原子力显微镜特点及其在食品中的研究进展

李芳菲，夏秀芳，孔保华

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

原子力显微镜特点及其在食品中的研究进展

李芳菲，夏秀芳，孔保华*

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

原子力显微镜具有高的空间分辨率、操作过程简单快捷，是一种应用广泛的显微分析仪器。原子力显微镜能够在非大气环境下进行试验，可以广泛应用于物理、化学、生物材料、食品、电子学等领域。介绍原子力显微镜的工作原理、功能特点及作用模式，并综述了其在食品科学研究领域中的研究进展。

原子力显微镜；原理；功能特点；模式；研究进展

随着人们对微观世界的不断探索，很多普通光学显微镜无法观察到的物质内部微观结构逐渐成为人们关注和研究的热点，而普通分子技术的局限性也日益突出。20世纪80年代中期由Binning等在扫描隧道显微镜（Scanning Tunnel Microscope，STM）基础上发展起来一种更加精密的显微工具，原子力显微镜（Atomic Force Microscope，AFM）［1-2］。原子力显微镜主要是通过原子级的探针对样品表面进行“扫描”，二者间的相互作用使装配探针的微悬臂发生轻微形变，通过检测微悬臂的形变程度，便可以得到样品表面与探针之间的相互作用力大小；在探针沿样品表面进行扫描时，保持尖端与表面原子力恒定所需施加于压电材料两端的电压波形［3］，就能得到待测物质表面总电子密度的形貌，从而弥补扫描隧道显微镜无法观测非导电样品的缺憾［4］。原子力显微镜使用方便、操作简单，已应用在生物材料、化工工业、食品等多个不同领域。本文将从原子力显微镜的原理出发，简述其功能特点和模式，并综述其在食品科学研究中不同产品和不同组分中的研究进展。

1　原子力显微镜

1.1原子力显微镜及其成像原理

作为最新的显微检测仪器，AFM是对人类视觉感官功能的有力延伸和增强，与普通光学显微镜相比，AFM的成像效果更加全面和先进。AFM的一端是固定的，另一端是装有纳米级尖锐微小针尖的弹性微悬臂，当探针在样品表面扫描时，探针针尖与样品表面产生相互作用力，该作用力会使微悬臂产生形变［5］，由激光束发出的激光会直射到微悬臂的背面，微悬臂将激光发射到光电检测器上，使之转换为电信号输入计算机，即使是小于0.01 nm形变也可以在光电检测器上显示出大约10 nm的位移，经处理获得样品的表面特征信息（如图1）［6］。近年来为了更加详细深入的了解样品纳米级信息，由轻敲模式又发展出相位成像模式，这种成像方式是通过检测驱动微悬臂探针振动的信号源的相位角与实际微悬臂探针振动的相位角之差（即两者的相移）的变化来成像，这种方式得到的样品表面信息更加丰富准确［7］。

图1　原子力显微镜原理图Fig.1The principle diagram of the atomic force microscope

1.2原子力显微镜的功能及特点

用肉眼看到的自然界中物质大多数是平整光滑的，实际上物质表面都存在我们无法直接观察到的、及其微小的孔隙和颗粒状结构。AFM就是通过探针和样品表面之间的作用力，使微悬臂产生形变，由此将二者之间的相互作用力以力-距离曲线的形式展示出来，再对曲线进行分析，并且将分析后得到的样品形貌特征通过图像的方式清晰的展示出来。从样品的宏观上来说，AFM可以检测样品表面的粗糙程度、孔隙结构、颗粒度等，有助于我们了解物质的表面物化属性；除了对物体表面的观察外，AFM还能够得到该物质的晶体结构、分子聚集状态等一系列的信息［1］，有助于我们了解物质的理化性征；此外，我们还可以利用探针与分子的结合程度来了解分子的拉伸弹性、空间结构等，有助于我们更好的了解分子属性。

AFM是通过检测样品-探针间的相互作用力来完成高分辨率成像的。原子力显微镜特殊的作用方式具有以下4方面的优势：1）检测样品的材质广泛，导体、半导体、瓷器、金属甚至是生物细胞等都可以作为检测对象［1］；2）制样简单不繁琐，甚至无需处理，只需对样品进行简单固定即可，省去了切片、脱水、染色、制片等复杂程序，不仅对样品破坏性小，而且节省检测时间；3）适应于各种工作环境，包括液体、空气和真空甚至是生理条件下直接成像，而且还可以对活体细胞进行实时动态观察；不论是常温还是低温等条件，AFM都能够正常工作，有助于使样品保持最佳状态；4）能提供生物分子和生物表面纳米级分辨率的三维图像，还有局部的电荷密度和物理特性等精密细节［8］，在这一点上它明显优于普通光学显微镜，这将有助于人类更细致的探究未来世界。

1.3原子力显微镜作用模式

AFM是一种具有原子级的高分辨率的显微工具，它是通过控制并检测样品－针尖之间的相互作用力完成成像的［9］，当探针与样品之间的工作距离不同时，原子力显微镜的工作状态也不同，由此可将原子力显微镜的作用方式分为3种：接触模式、非接触模式以及间歇接触模式。

1.3.1接触模式

接触模式又称为DC模式，主要通过探针与样品表面始终接触产生的作用力使悬臂发生形变［2］，其中包括恒力和恒高两种模式。在三维空间体系中，保持微悬臂的偏转程度不变，即探针和样品之间的作用力恒定，当沿x、y方向扫描时，记录z方向上扫描器的情况从而得到样品表面形貌特征，这种模式称为恒力模式，该模式适用于物质的表面分析；恒高模式指样品和针尖的相对高度不变，通过微悬臂的偏转程度来反映样品表面形态，由于这种模式对样品的高度比较敏感，能够快速扫描样品，因此适用于分子、原子的图像观察。接触模式主要就是依靠探针和样品之间的斥力得到相对稳定、分辨率高的图像，但是由于探针和样品接触频繁，因此容易使探针变型，同时对样品也会有不同程度的损伤［10］。

1.3.2非接触模式

非接触模式又称为AC模式［2］，该模式下探针与样品表面始终存在一定的距离，大约5 cm～20 cm，并且探针和样品间是通过保持微悬臂共振频率或振动幅度控制的，因此AC模式对待测样品破坏或移动的可能性较小，适用于疏水性液体表面等，并且该模式灵敏度较接高，但弊端就是分辨率较低，工作效率低［10］。

1.3.3轻敲模式

一般而言，大多数生物样品更适合第三种模式“轻敲模式”，是AFM中最常用的一种模式，该模式下探针处于振动状态，在垂直方向上敲击样品表面，从而获得样品表面的形貌特征，与样品表面间断接触的过程中摩擦力和剪切力对样品的影响相对较小，这样既能保证高的分辨率，又能将接触对探针和样品的破坏降到最低，所以这种方法适合柔软细致以及粘性较大的样品［11-12］。一般轻敲模式要优于非接触模式，尤其是作用于样品表面较大范围的扫描成像，而且该模式还可以在液体环境下使用［13］。

2　原子力显微镜在食品科学中的研究进展

2.1AFM在不同类型食品中的应用

2.1.1肉及肉制品

随着科技的发展，人们的生活水平不断提高，在维持温饱的基础上，人们对于食品的品质也有更高的要求，尤其对肉品品质的要求也越来越高。肉的嫩度是衡量肉品品质极非常重要的指标之一。因此，人们对肉的嫩度越来越重视，对肉的嫩度的研究也越来越深入。

肉的嫩度是指肉入口咀嚼时所感觉的印象，包括入口时是否易被咬开、咀嚼难易程度以及在口中的残留量，肉越嫩就越容易咀嚼，反之肉质越老［14］。肌肉的嫩度与肌肉蛋白分子之间的相互作用力、结缔组织的分布情况以及脂肪含量息息相关，通过调节pH、添加胰蛋白酶等方法都可以改变肉的嫩度［15］，考察嫩度常用指标是剪切力值和肌原纤维小片化指数，除了常规测定剪切力的方法，我们还可以用原子力显微镜进行观察。李林强等［16］分别将牛肉用浓度为100、150、200 mmol/L的CaCl2处理，于4℃真空包装储藏72 h，用AFM观察肌原纤维小片，准确的得出了肉嫩化程度的结果；周芳等［17］用AFM对肌原纤维进行扫描，发现不同浓度Ca2+处理的牛肉嫩度一定会有改善，并且随着Ca2+浓度的增加肌原纤维降解增多，说明肉的嫩度越大。利用AFM对肉的嫩度的测定，不仅比普通测定方法更加方便，而且是对剪切力和肌原纤维小片化指数形态学上的完善，有助于我们进一步研究有关于改善肉嫩度的方法。

2.1.2乳及乳制品

乳是一种复杂的胶体体系，胶体体系的稳定性是食品质量加工的重要性质，利用AFM能够更准确的对体系表面作用力相关信息进行研究。Kirby等［18］通过AFM对牛血清蛋白和酪蛋白在十二烷烃/水、空气/水界面膜图像结构，AFM图像能够观测到两种体系中不同的网状结构，结果显示圆状球体结构是单个牛血清蛋白分子，界面膜的二维网状结构是由独立的蛋白质分子组成的。因此利用原子力显微镜能够系统全面的了解乳胶体的表面信息以及胶体结构等。王丽娜等［19］以水牛奶酪蛋白、乳牛奶酪蛋白和山羊奶酪蛋白为原料，利用激光粒度分析仪和原子力显微镜研究三者蛋白粒径分布情况以及zeta电位及表面颗粒形态上的差异，结果发现三种蛋白均呈现球行或椭球形，其中水牛奶酪颗粒分布较均匀，而另外两种乳源蛋白颗粒有明显的聚集行为，并综合本试验中的其他结果得出牛乳蛋白氨基酸稳定性较羊乳蛋白稳定性强，为后来研究乳品蛋白功能特性等提供理论基础。

2.1.3粮食作物

Wang等［20］在研究氯乙酸和油酸对玉米蛋白自组装结构的影响以及类胡萝卜素的含量对玉米蛋白质结构的影响时，利用AFM对吸附于亲水和疏水表面的玉米蛋白层表面形貌进行观察，结果显示其亲水性表面的粗糙程度比环形结构大，而疏水表面的玉米蛋白膜没有明显的特征，由此得出类胡萝卜素以及氯乙酸和油酸对玉米蛋白表面形貌的影响。张良等［21］在空气中利用AFM的轻敲模式在新解离的云母片上获取不同类型白酒的纳米级成像，尽管针尖接触白酒可能对成像造成一些影响，但是通过研究成像效果较好的图像可以看出，不同类型的白酒所含颗粒的形状有球形、锥形和扁平状等不同形状，而且由于生产工艺、气候等因素的影响使颗粒的分布和大小也有区别，由此构成不同香型白酒特殊的纳米图谱，实现了在纳米水平上对白酒香型的研究。

2.2AFM在研究不同食品组分中的应用

对食品组分的研究往往要从微观角度探究其结构特性，从而理解其宏观状态下的性质。多糖、蛋白质和脂质作为食品中的重要组分，不仅具有重要的营养价值，对食品品质的形成也具有不可或缺的作用。

2.2.1多糖类

多糖物质是许多食用胶等作为食品加工中的增稠剂和稳定剂，对食品的组织结构和特性有着非常重要的作用。多糖含有多条支链，分子的均一性和线性比DNA和蛋白质差一些，因此在空气中成像的分辨率较低，而利用原子力显微镜能够很好的解决这个问题。

卡拉胶具有连续的连结结构，通过分子双螺旋结构以及离子作用使分子末端与中间相连接，在干燥的空气中容易形成薄膜结构，Morris等［22］利用AFM观察卡拉胶发现其呈现纤维网状结构，该结构在Gunning等［23］的研究中同样得到证实；Kirby等［24-25］利用AFM的轻巧模式观察沉积在云母片中的黄原胶结构时，从图像中可以看出其分子间相互缠绕，每个网点宽为1.6cm，高约为3.3 cm，与扫描方向垂直的方向上有10 nm厚的分子带，比文献中记载的黄原胶的螺旋尺寸略大；此外，Gunning等［26］利用AFM检测新几内亚微小卡拉胶时，得到了卡拉胶中的水溶性及非水溶性部分的结构，尤其是不溶性部分的网状纤维素的结构。

许多食品的宏观形态类似而微观结构却相差甚远，尽管如此它们之间也存在着紧密的联系，用原子力显微镜能够观测得到比扫描电镜上更加精密的数据，比如比较明显的凹凸不平、食物残留物等细节［27］。王博等［28］在研究酶对淀粉颗粒的作用，AFM能观察微孔的形成过程，在这一点上比扫描电子显微镜更加全面和详细；而Leslaw和Juszczak等［29-30］采用AFM接触模式深入研究了淀粉表面的形貌，结果显示玉米淀粉和木薯粉颗粒表面比较平滑。利用原子力显微镜高分辨率成像的优势不仅能够更加细致的了解多糖物质的微观结构，也能分析不同组成对物质宏观性质的影响。

2.2.2蛋白质

蛋白质是食品中典型的营养成分，也是人们生存必不可少的物质，而有利用原子力显微镜检测蛋白质也已经成为一种常用手段［31］。在食品加工过程中，蛋白质的结构可能随着加工过程发生变化，原子力显微镜为蛋白质结构的研究提供了新的思路。郭云昌等［32］研究玉米醇溶蛋白的纳米层次时，在AFM检测下发现乙醇溶液中的醇溶蛋白是以球状颗粒结构存在的，而云母表面的醇溶蛋白则是均匀的网状结构，具有较好的成膜特性，由此得出网状结构是醇溶蛋白成膜的结构基础。

在食品加工过程中除了蛋白质的结构特征外，蛋白质凝聚和凝胶也非常重要，蛋白质凝胶的形成，是变性的蛋白质分子的聚集现象，而在聚集的过程中，如果分子间的吸引力和排斥力不平衡时，会形成相应的凝结物或者凝胶体［33］，因此只有处于一种平衡的状态，才能形成高度有序的保水结构即为凝胶。芦鑫等［34］利用AFM的轻敲模式观察加热后的β-乳球蛋白，结果发现低pH和低离子强度条件有助于β-乳球蛋白纤维体的形成；Iwasaki等［35］观察发现70℃时原本串珠结构的肌浆球蛋丝变成了绳子结构，少量蛋白丝的结构没有显著变化；Yang等［36］利用AFM观察鲶鱼凝胶结构时发现球状凝聚体和环形空洞的形成与离子渗透过胶原质时的方式有关。应用AFM还可以测定蛋白质或者其他聚合物的凝胶体系，Cecilia Elofsson等［26］将原子力显微镜与光学显微镜、流体力学相结合，观察不同的溶液浓度、离子强度下冷凝胶乳清蛋白溶液中的微粒，发现不同处理条件下凝胶溶液的组织结构不同；Shinya Ikeda等［37］结合拉曼光谱和流体力学的实验，对不同离子强度、pH条件下热诱导乳清蛋白凝胶前体溶液，发现该溶液是由椭圆形颗粒组成的，并且随着离子强度的增加，乳清蛋白由半透明凝胶转变为不透明凝胶。因此通过原子力显微镜和其他技术的联合使用对蛋白质凝胶过程中溶液的观察，得到高分辨率的组织结构成像以及不同条件下凝胶溶液中的微粒形态等，从而更深入的分析蛋白质聚集体形成过程和作用，这对建立有利于食品品质与口感的凝胶形成体系具有十分重要的意义。

2.2.3脂质

脂质是食品中重要的大分子物质、能量的最佳储存方式以及细胞膜的骨架结构。脂质体的理化性质一直是科学家们关注的热点之一，脂质体的结构稳定性非常重要，赵琰等［38］利用原子力显微镜测定大豆卵磷脂中的脂质体的刚性和粘性并建立数学模型，结果显示其粘连性和刚性可以定量的评价脂质体的结构稳定性；赵新军等［39］利用AFM研究能力蔗糖溶液中二棕榈酰磷脂酰胆碱磷脂双分子层的结构，并分析其结构特性和杨氏模量；Patino等［40］利用AFM研究了二棕榈酰磷脂酰胆碱和二油酰磷脂酰胆碱在水-空气界面处的结构特性，结果显示磷脂分子层在纳米级水平上的不均一性，由此使AFM在检测纳米级脂质的表面信息上更加细致；Shibata-Seki等［41］利用AFM测得观测发现脂质体在溶液环境是直径约200 nm～300 nm的气球状，而光散射显微镜测得其平均直径约为180 nm，二者大体上吻合；Dufrêne等［42］通过AFM观察支撑脂质膜的分子结构、在空气中单层或多层膜的结构以及在水环境中的脂质双层膜的结构等，并讨论分离相单分子膜的形状和分子结构以及成膜的组织特性。利用原子力显微镜检测不同水平上脂质体的微观结构及表面特性，为我们进一步了解脂质的属性提供重要依据。

3　展望

原子力显微镜凭借它高分辨率、测样材料广泛、制样简单等特点在现代科技领域中越来越受到人们的重视，同时AFM技术也是一种“年轻”的技术，尚存在一些局限性，首先，接触模式和轻敲模式下探针和样品的接触都会造成针尖的污染和变型，会影响其分辨率，如果用液体对针尖进行清理，针尖和液体之间的相互作用又会带来新的问题；第二，尽管样品不用特殊固定，但是一般需要加入缓冲液，存在盐离子结晶的情况，另外AFM很难对样品进行宏观定位，而且针尖的曲率半径和样品的柔韧性也会影响仪器的分辨率，导致结果的误差。

随着对AFM越来越深入的研究，很多科学家就其局限性进行一定程度上的改进，大体上分为以下方面：1）碳纳米管针尖衍化：碳纳米管是一种纳米级、分子结构完整的新型碳材料，具有较高的弹性和机械柔软性，并且结构稳定，能够很大程度上提高原子力显微镜的分辨率；2）探针的制备与功能化；3）实现纳米操纵：AFM针尖作为“纳米镊”，通过在分子的特定部位上加载力大小的改变实现纳米操纵；4）多功能悬臂：这类悬臂有热电偶、纳米管、近场光学探针等；5）单分子力谱是在AFM研究的基础上逐渐发展起来的单个分子力学性质测定方法，代表着AFM应用的重要方向［43］。为了更好的在各个领域发挥作用，这种精密的分析测试仪器自身也在不断改进的过程中，我们也将不断的加深对原子力显微镜的研究，将其与不同领域相结合，不仅能够拓展应用范围，也可以开辟新的技术。我们将继续研究原子力显微镜与其他技术的结合应用，不断完善这项技术，让它更好的发挥功能。

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The Research Progress of Characteristics of Atomic Force Microscopy and Its Advance in Food Science

LI Fang-fei，XIA Xiu-fang，KONG Bao-hua*
（College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China）

Atomic force microscopy（AFM）is a micro analysis apparatus with the characteristics of high spatial resolution，simple operation，and widely application.AFM can be used in non atmospheric environment，so it is widely used in physics，chemistry，biological materials，food，electronics and other fields.The working principle，functional characteristics and function mode of AFM were introduced，and its advance in food science research was summarized.

atomic force microscopy（AFM）；principle；functional characteristics；pattern；advance

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.052

黑龙江省应用技术研究与开发重点计划（GA15B302）；国家自然科学基金（31471599）

李芳菲（1993—），女（汉），硕士在读，研究方向：畜产品加工。

孔保华（1963—），女，教授，博士生导师，研究方向：畜产品加工。

2016-04-11