HPLC法测定发酵山楂红酒13种单体酚的含量

江胜龙

（玉林市产品质量检验所，广西玉林537000）

HPLC法测定发酵山楂红酒13种单体酚的含量

江胜龙

（玉林市产品质量检验所，广西玉林537000）

建立了山楂红酒中13种单体酚测定的HPLC分析方法，并对不同时期山楂红酒单体酚的含量进行了测定。结果表明，用该方法对山楂酒中的13种单体酚进行分析，各成分具有较好的分离度，相对标准偏差在0.94%～3.62%之间，线性范围在14.2～500 ng之间，最低检出限为1.78～14.2 ng，回归方程的相关系数r介于0.9994～0.9999之间，实现了在33 min内同时对山楂红酒中13种单体酚进行分析检测。随着时间的延长，单体酚呈下降趋势。

山楂酒；多酚；HPLC

山楂（Crataegus pinnatifida）属于蔷薇科山楂属植物，世界上共有该属植物1000余种。山楂酸甜可口，具有消食健胃、行气散淤、抗氧化、防衰老等功效［1］。多酚［2］、低聚原花青素［3］、黄酮［4］是果酒中主要活性物质。适宜的多酚摄入量与人体血管健康密切相关［5］。山楂酒酒精度低，并含有糖类、氨基酸、多种有机酸及丰富的维生素和矿物质，山楂酒里含有大量的多酚［6］，不仅能够抑制脂肪在人体中的堆积，而且还有生津止渴、润肺和补肝安神的保健作用。

果酒中酚类物质的来源是水果本身，原花青素是中国山楂中最主要的活性成分，是由结构单元表儿茶素（EC）以C4→C8键或C4→C6键缩合而成的聚合体。此外山楂中还含有绿原酸（CA）、红果酸（EA）以及少量的金丝桃苷（HP）、异栎素（IQ）等。这些多酚类成分是山楂中最具代表性的活性成分［7］。然而到目前为止关于山楂酒中的这些主要多酚的组成、含量分析还未有任何报道。本实验采用山楂鲜果为原料，参照葡萄酒发酵工艺，采用HPLC法测定山楂酒中13种单体酚的含量及变化。

1　材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

材料：山楂，河北承德产；葡萄酒果酒专用酵母，安琪酵母有限公司；食用级白砂糖，市售；亚硫酸，天津大工化学试剂有限公司；Epicatechin，Procyanidins B2（B2），Procyanidins B5（B5），Procyanidins C1（C1），Procyanidins C2（C2），Procyanidins C3（C3），Procyanidins D1（D1），Procyanidins D2（D2），Procyanidins D6（D6），Eucomic acid（EA），Hyperoside（HP），Isoquercitrin（IP），Chlorogenic acid（CA）实验室自制。

仪器：Agilent 1200型（安捷伦公司，美国加州帕罗阿托市），由在线脱气机，四元输液泵，Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm id，5µm），光电二极管阵列检测器及Agilent Chemstation色谱工作站组成。配用CO-3010柱恒温控制箱（天津美瑞泰克科技有限公司生产）；TB-215D分析天平，德国赛多利斯股份有限公司；WYT-4型手持折光仪，日本ATAGO有限公司；酒精计，河北省河间市黎民居玻璃仪器制品厂。

1.2实验方法

1.2.1山楂红酒发酵的工艺流程

山楂前处理（挑选、去核、去柄）→破碎→添加40 mg/L SO2→搅拌→添加活性干酵母→搅拌→发酵→发酵结束→添加SO2→密封→澄清→山楂红酒成品

1.2.2山楂红酒13种单体酚含量测定

样品处理：取3 mL山楂酒，加入9 mL无水甲醇，提取5 min，离心（4000 r/min，5 min），取上清液10 mL，用氮吹挥干，用1 mL 50%甲醇回溶，用0.45 μm微孔滤膜过滤，待用。

色谱条件：流动相：A：500µL/L甲酸水溶液；B：甲醇∶乙腈=5∶4，含500µL/L的甲酸；梯度洗脱程序（min/ B%）：0/15.2，11/15.2，15/16.5，16/18，19/19.5，24/29，31/ 50，33/80，38/80，40/15.2，50/15.2；DAD检测器，检测波长：280 nm；流速：0.8 mL/min；温度：35℃；进样量：10µL；峰面积外标法定量。

2　结果与分析

2.113种单体酚分析方法建立

采用1.2.2色谱条件对13种单体酚成分的标准品进行分析，图1为标准品的色谱图。如图1所示，13种单体酚成分在该色谱条件下给出了单一的色谱峰，各成分得到了较好的分离效果。

图1　山楂红酒中原花青素各成分HPLC色谱图

2.2方法的精密度实验

将CA、EA、EC、B2、B5、C1、C2、C3、D1、D2、D6、HP、IQ对照品溶于甲醇中，配制成0.5 mg/mL的混合对照品贮备液，取上述对照品贮备液，用甲醇稀释13倍，按1.2.2中所述的色谱条件重复进样分析（n=5），以评价方法的精密度。数据统计结果见表1。可以看出，13种对照品的精密度都很好。

2.3方法的回归方程、线性范围和最低检出限

表1　精密度评价（n=5）

分别取贮备液，用甲醇稀释，配制不同浓度的系列标准溶液，按1.2.2所述色谱条件分析，以进样质量为自变量（X，μg），峰面积为因变量（Y，mv·s），分别计算各成分的线性回归方程、相关系数及线性范围。最低检出限以3倍信噪比（S/N）所对应的进样质量求得，结果见表2。结果表明，响应值与进样质量之间线性关系良好，最低检出限在ng数量级，可以满足常规样品的定量分析。

表2　13种酚类成分的回归方程、相关系数、线性范围及最低检出限

2.4方法的加标回收率实验

本实验以山楂红酒中主要的原花青素B2、EC、CA为对照品，采用加标回收率法对方法的准确度进行评估。分别准确称取已知质量的对照品，分别按1.2 mg/g、0.5 mg/g、0.25 mg/g水平加入山楂红酒样品中，按1.2.2所述进行样品前处理，平行5份；并按1.2.2所述色谱条件分别测定未加标样品和已加标样品，统计计算各成分的加标回收率，结果见表3。由表3可知，3种原花青素的回收率均较高，可以满足实验需要。

表3　各成分回收率

2.5样品分析

按1.2.2进行山楂红酒前处理，采用1.2.2 HPLC方法对不同时期山楂红酒进行多酚含量分析，结果见表4。

在这些酚类成分中，酚酸和黄酮类成分的含量下降较为平缓，原花青素类成分的含量下降较为显著，包括含量最高的B2、EC等小分子成分在内，2年之后的山楂红酒中含量下降到不足10%的水平。

表4　山楂红酒不同时期多酚含量（μg/g）

3　结论

3.1本研究开发了一种以甲醇-乙腈-水组成的三元流动相梯度洗脱高效液相色谱方法，实现了在33 min内对山楂红酒中的13种酚类成分同时进行分析检测。方法的评价结果表明，本方法具有较好的准确度、精密度和灵敏度，样品前处理简单，适用于对山楂红酒样品中主要多酚成分进行质量监控。

3.2随着发酵、陈酿时间的延长，山楂红酒中原花青素含量呈下降趋势。

［1］李琴琴.山楂概述［J］.科技资讯，2007（9）：238.

［2］Frankel E N，German J B，Kinsella J E，et al.Inhibition of oxidation of human low-density lipoprotein by phenolic substances in red wine［J］.The Lancet，1993，341（8843）：454-457.

［3］Wang H，Race E J，ShrikhAJ.Anthocyanin transformation in Cabernet Sauvignon wine during aging［J］.JAgric Food Chem，2003，51（27）：7989-7994.

［4］Burda S，Oleszek W.Antioxidant and antiradical activities of flavonoids［J］.JAgric Food Chem，2001，49（6）：2774-2779.

［5］Theobald H，Johansson S E，Engfeldt P.Influence of different types of alcoholic beverages on self-reported health status［J］. Alcohol andAlcoholism，2003，38（6）：583-588.

［6］Bagchi D，Bagchi M，Stohs S J，et al.Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract:importance in human health and disease prevention［J］.Toxicology，2000，148：187-197.

［7］Cui T，Li J Z，Kayahara H，et al.Quantification of the polyphenols and triterpene acids in Chinese hawthorn fruit by high-performance liquid chromatographic［J］.JAgric Food Chem，2006，54：4574-4581.

Determination of the Content of 13 Kinds of Polyphenols in Hawthorn Wine by HPLC

JIANG Shenglong
（Yulin Product Quality Inspection Institute，Yulin，Guangxi 537000，China）

In this study，HPLC was applied to detect the content of 13 kinds of polyphenols in hawthorn wine in different periods.The results suggested that，each polyphenol was separated well，RSDs were between 0.94%to 3.62%，the linear range was within 14.2～500 ng，the minimum detection limit was between 1.78～14.2 ng，and the correlation coefficients（r）were between 0.9994～0.9999.These 13 kinds of polyphenols were determined within 33 min.The polyphenol content in hawthorn wine decreased as time passed by.

hawthorn wine；polyphenols；HPLC

TS262.7；TS261.4；TS261.7

A

1001-9286（2016）10-0115-03

10.13746/j.njkj.2016198

2016-06-13

江胜龙（1980-），男，硕士，工程师，从事食品生产监督管理工作，E-mail：363252880@qq.com。

优先数字出版时间：2016-08-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160803.1028.005.html。