显色固液双相培养基快速检测结核分枝杆菌的临床应用评价

王智存,白广红,施　婕,邹远妩,王　卓,朱　蕾,李晓晓

(陕西省结核病防治院，西安 710100)



·临床研究·

显色固液双相培养基快速检测结核分枝杆菌的临床应用评价

王智存,白广红,施婕,邹远妩,王卓,朱蕾,李晓晓

(陕西省结核病防治院，西安 710100)

目的探讨固液双相培养基快速检测结核分枝杆菌的临床价值。方法对350例患者的痰标本分别进行涂片抗酸染色、改良罗氏培养法、固液双相培养法、Bactec 960培养法检测。结果350例痰标本涂片抗酸染色法阳性率为14.8%，改良罗氏培养法为24.0%，固液双相法为35.7%，Bactec 960培养法为40.3%，改良罗氏培养法与涂片抗酸染色法比较，差异有统计学意义(P<0.01)，固液双相培养法与改良罗氏培养法比较，差异有统计学意义(P<0.01)，固液双相培养法与Bactec 960培养法比较，差异无统计学意义(P>0.05)。改良罗氏培养法平均报告阳性时间为21.5 d，固液双相培养法液相平均为13.2 d，固相为16.4 d，Bactec 960培养法平均为11.8 d。结论固液双相培养法操作简便，阳性率高，时间短，适合基层医院快速检测结核分枝杆菌。

结核分枝杆菌；培养； 结核病

全国第5次结核病流行抽样调查报告，2010年全国人口有活动性肺结核患者499万例，乡村明显高于城镇，无症状肺结核患者比例明显增加，有症状患者初诊结核病院或专科医院仅占3.2%[1]。结核病防治的关键是早期诊断，早期治疗。涂片抗酸染色率低(10%～20%)，我国普及和通用方法为改良罗氏培养法，但时间长(8周)，液体快速培养法(Bactec 960培养基等)营养成分高，速度快，平均报告阳性率时间13 d，但价格昂贵，需特殊仪器，不能在综合医院和基层医院普及和应用。现探讨结合液体和固体培养基特点，研究显色固液双相培养基应用于临床的效果。报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料350例痰标本来自2014年5～12月该院门诊和住院患者采集的清晨痰液，标本量3～5 mL，形状为干酪痰、血痰、黏液痰，排除唾液样痰标本，同一患者只使用1份痰标本。

1.2培养基改良罗氏培养基(7毫升/支)购自珠海贝索生物技术有限公司，Bactec 960培养基和添加剂购自BD公司，固液双相培养基以改良罗氏培养基为基础，加入含10%添加剂的7H9液体培养基4 mL，约占斜面的一半。

1.3方法

1.3.1痰标本消化处理痰标本涂片抗酸染色后加入1～2倍体积NALC-NaOH混合溶液震荡，消化离心处理[2]。

1.3.2接种培养标本加200 μL至改良罗氏培养基和固液双相培养基；Bactec 960 7H9培养基加标本500 μL，置Bactec 960中培养检测。改良罗氏法还需37 ℃平卧放置斜面24 h后直立放置，培养后3、7 d观察细菌生长情况，此后每周观察1次，培养阳性随报告罗氏培养基结果观察及判断参考《结核病诊断实验室检验规程》进行[3]。固液双相培养基第9天加入过滤除菌0.1 g/L刃天青(沃凯公司)显色液30 μL至固液双相培养基，颜色从蓝色变为粉红色,即利于细菌生长。

1.4统计学处理采用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计数资料以百分率表示，组间比较使用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.14种方法检测痰标本的结果比较改良罗氏培养法与涂片抗酸染色法比较，差异有统计学意义(χ2=9.34，P<0.01),固液双相培养法与改良罗氏培养法比较，差异有统计学意义(χ2=11.466，P<0.01),固液双相培养法与Bactec 960培养法比较，差异无统计学意义(χ2=1.55，P>0.05)；改良罗氏培养法污染率为2.0%，固液双相培养法为2.6%，Bactec 960培养法为5.42%。见表1。

表1　　4种方法检测痰标本结果比较

注：-表示无数据。

2.23种方法报告阳性时间结果比较改良罗氏培养法平均报告阳性时间21.5 d，固液双相培养法液相13.2 d，固相16.4 d，Bactec 960培养法11.8 d。见表2。

表2　　3种方法培养结核分枝杆菌阳性耗时结果比较(n)

注：-表示无数据。

2.32种方法检测阳性菌落结果比较固液双相培养法与改良罗氏培养法阳性菌落(++、+++、++++)结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)，菌落(+)差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3　　2种方法检测阳性菌落生长结果比较(n)

3　讨　　论

探讨适合我国结核病疫情的细菌学检查方法，早期发现传染源，规范治疗避免耐药性和减少疫情传播极为重要。

结核分枝杆菌培养法作为结核病诊断的“金标准”，传统罗氏培养法3～8 周才能得到结果，Bactec 960培养法等液体培养基营养丰富，可使用仪器进行连续监测，平均报告阳性时间为13 d，具有自动化和高灵敏度优点[4]。

本研究结果表明，涂片抗酸染色法阳性率为14.8%，改良罗氏培养法24.0%，固液双相培养法为35.7%，Bactec 960培养法为40.3%。固液双相培养法与涂片抗酸染色法、改良罗氏培养法比较，差异有统计意义(P<0.05)，与Bactec 960 培养法比较，差异无统计学意义(P>0.05)。固液双相培养基采用固液双相一体化统计，其营养丰富，可减少污染，提高阳性率，孔雀绿可进一步避免杂菌污染，分离纯化获得单个菌落，对结核分枝杆菌有促进生长的作用。培养阳性菌落直观明白，省去抗酸染色步骤，减少工作量，为结核分枝杆菌药敏试验奠定基础，Bactec 960培养阳性管中结核分枝杆菌形成条索状[5]。7H9培养管培养基对菌液浓度配制时浊度影响，使细菌浓度较难控制，影响药敏试验中细菌接种量，造成药物敏感试验结果不准确。

改良罗氏培养法平均报告阳性时间21.5 d，固液双相培养法液相平均时间13.2 d，固相平均时间16.4 d，Bactec 960培养法11.8 d。结核分枝杆菌生长缓慢：(1)标本经酸或碱处理后直接接种至培养基，至少需2～3 d 培养基才能缓冲酸碱，达到pH 7.2左右，而本组固液双相培养基接种pH 6.8 PBS消化混合液后，减少培养基缓冲时间[6]。(2)细菌在固体培养基不能有效吸收营养成分而导致细菌对数生长期延长，改良罗氏培养基接种后需倾斜，平放斜面24 h以便细菌充分接触培养基，细菌在双相培养基内可使细菌浸泡在营养成分中以利于新陈代谢，对数生长期提前，省去改良罗氏培养基平卧放置斜面的操作，操作简便快捷。液体培养基阳性标本呈絮状沉淀生成，难以鉴别杂菌污染，而固液双相培养基生长的菌落则呈典型菜花状，易于判断。刃天青是一种氧化还原指示剂，在氧化状态呈紫蓝色，且在还原状态下呈粉红色或红色还原产物。通过培养结核分枝杆菌还原刃天青盐从而判断细菌是否生长[7]。该方法显色剂用量少，不需仪器，比较方便，可快速检测液相中是否有结核菌生长。实际应用中加入刃天青试剂后一般需要过夜培养。张朝宝等[8]研究XTT/mpms试剂只需继续培养4 h，且XTT/mpms和TH9培养基37 ℃恒温培养时间至少在7 d内保持相对稳定，其工作浓度对分枝杆菌具有低细胞毒性。

综述所述，固液双相培养法操作简便，试剂成本低，阳性率高，不需特殊仪器，阳性平均时间比改良罗氏培养法提前1周，便于综合医院和基层医院检测结核分枝杆菌，具有一定的临床价值。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.042

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1673-4130(2016)19-2756-02

2016-03-12

2016-05-17)