离心条件对凝血三项检测结果的影响及分析

马学斌，白　璐，赵强元

(中国人民解放军海军总医院检验科,北京 100048)



·论著·

离心条件对凝血三项检测结果的影响及分析

马学斌，白璐，赵强元

(中国人民解放军海军总医院检验科,北京 100048)

目的验证该实验室常规凝血检测离心条件并探讨建立优化离心条件。方法以该院体检者及住院患者为研究对象，分为常规组、标准组、提速组。应用不同离心条件离心获得乏血小板血浆(PPP)，进行常规凝血项目凝血酶原时间(PT)、国际标准化比率(INR)、纤维蛋白原(FIB)、活化部分凝血活酶时间(APTT)的检测；其次对不同血小板含量的标本采用常规条件和标准条件离心后，检测血浆中剩余血小板含量。结果常规组和提速组的凝血常规各项检测结果与标准组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；血小板浓度低于500×109/L时，常规条件和标准条件离心后PPP 100%合格，血小板浓度高于500×109/L时合格率降低为64%。结论目前的常规离心条件可以满足常规凝血检测，对特殊类型凝血检测及血小板浓度高于500×109/L的标本，需要严格按照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)的要求进行离心处理。

凝血检测；离心条件；乏血小板血浆

凝血检测已广泛应用于患者凝血因子和凝血功能的诊断，出血和血栓性疾病的诊断，抗凝药物和因子替代治疗的监测，以及特异性和非特异性抗凝物质的筛查等[1]。凝血检测结果的准确性受多种因素的影响，其中检验前处理程序尤为重要[2]。枸橼酸钠抗凝的全血标本在进入分析前，需以一定的速度和时间离心而获得乏血小板血浆(PPP)。《全国临床检验操作规程(第3版)》规定活化部分凝血活酶时间(APTT)检测要求3 000 r/min离心10 min，凝血酶原时间(PT)低速分离血浆即可。根据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)指南于2015年制定的《中华人民共和国卫生标准汇编·临床检验标准卷》为1 500 g离心15 min。本实验室根据第3版要求采用3 000 r/min离心10 min，但能否满足新的国家标准，尚未进行验证；同时为有效缩短凝血标本检测的周转时间(TAT)，对提高离心转速缩短离心时间是否可行也需作进一步的验证。本研究探讨不同离心条件对常规凝血检测项目的检测结果影响，包括：凝血酶原时间(PT)、国际标准化比率(INR)、APTT、纤维蛋白原(FIB)。对本实验室现行的离心条件进行验证，并进一步建立适合本室条件的凝血项目最佳离心条件。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2015年11月1日至12月30日该院健康体检者为研究对象，入选标准：(1)基本健康，既往无出血、血栓性疾病。(2)无心、肺、肝、肾和血液系统疾病史。共40例，男26例，女14例，年龄23～80岁，平均年龄(62±5)岁，进行不同浓度血小板PPP验证。选取该院住院患者，根据不同血小板浓度进行分组。

1.2仪器与试剂美国Instrumentation Laboratory公司的ACL-TOP700全自动血凝分析仪及配套试剂、质控品；日本西森美康XE-2100全自动血细胞分析仪及配套试剂、质控品；美国Backman DL电动离心机，离心半径12.5 cm。所有仪器均在良好状态下进行实验。

1.3方法

1.3.1不同离心条件对凝血项目的检测结果空腹状态下，用含109mmol/L枸橼酸钠0.3 mL的真空采血管采集受检者静脉血2.7 mL，轻轻颠倒混匀后，送到实验室。共收集40份标本，将每份平均分为3份，每份1 mL，分为常规组、标准组、提速组，分别按不同的离心条件进行离心。常规组按照第3版要求3 000 r/min离心10 min，标准组按照《中华人民共和国卫生标准汇编˙临床检验标准卷》要求1 500 g离心15 min，根据本实验室离心机的离心半径(12.5 cm)换算离心转速为3 302 r/min离心15 min，提速组使用3 600 r/min离心5 min。应用美国Instrumentation Laboratory公司生产配套冻干粉质控品，复溶后分杯-20 ℃冻存，每天早晨常规实验前取出，室温放置15 min溶解平衡后，混匀上机检测，质控在控下进行实验。PT和APTT均为凝固法；INR采用PT衍生计算法；FIB为Clauss法。所有标本均在采集后4 h内完成离心和上机检测。

1.3.2常规条件离心后PPP验证筛选同时检测全血细胞分析和凝血常规的标本，根据血小板检测结果分为3组：(100～300)×109/L组，(300～500)×109/L组，(500～800)×109/L组，每组20例，将凝血标本平均分成2份，按常规离心条件(3 000 r/min，10 min)和标准离心条件(3 302 r/min，15 min)平行进行离心后，检测PPP中剩余血小板含量。

2　结　　果

2.1不同离心条件对凝血三项检测结果的影响常规组离心条件3 000 r/min换算离心力为1 238 g，离心10 min，提速组3 600 r/min换算离心力为1 782 g离心5 min，标准组1 500 g离心15 min。3组离心后进行检测，3组间PT、INR、FIB、APTT两两比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。说明目前应用的离心条件及提速离心条件均能满足常规标本的检测要求。见表1。

表1　　不同离心条件下凝血检测结果比较±s)

2.2常规离心条件下PPP的验证结果血小板浓度(100～300)×109/L组和(300～500)×109/L组，常规离心条件下PPP中剩余血小板分别为(5.00±2.05)×109/L和(6.35±2.56)×109/L，2组PPP剩余血小板浓度均低于10×109/L；血小板(500～800)×109/L组，常规离心条件下PPP中有部分剩余血小板高于10×109/L，不合格标本占总例数的36%，而标准离心条件下PPP中剩余血小板全部低于10×109/L。见表2。

表2　　离心后PPP的验证结果

3　讨　　论

凝血常规检测结果的准确性与检测流程的标准化、室内质量控制及实验前多种因素显著相关，离心制备PPP是其中最关键的步骤，因而离心条件的验证对标准化检测流程，提高检测的准确性具有十分重要的临床意义。

《全国临床检验操作规程(第3版)》规定APTT检测要求3 000 r/min,离心10 min，PT低速离心分离血浆即可，其他项目无明确要求。由于各医院所用离心机品牌不同，型号不同，有效离心半径也不同，因而在相同转速条件下，获得相对离心力不相同，而相对离心力才是离心沉降的决定性因素。有研究表明，血小板磷脂与蛋白成分共同促进凝血酶原酶与凝血酶的形成，使整个凝血过程加速2×108倍[3]。推测血小板可使内源性凝血途径提速近1 000倍，如果离心时间不够，血小板未完全沉降，相应凝血的磷脂催化表面增加，从而严重影响检测结果。

CLSI建议常规凝血检测项目及特殊凝血检测项目离心获得合格的PPP，即血浆中血小板浓度低于10×109/L，要求离心速度为1 500 g，离心时间不少于15 min[4]。《中华人民共和国卫生标准汇编·临床检验标准卷(2015年版)》采纳CLSI的离心条件，作为我国凝血项目检测的国家标准。

有研究报道，以CLSI推荐的1 500 g为金标准，应用不同的离心力(3 000、1 500、1 000、500 g)离心分离获得PPP，然后检测各组离心后PPP中剩余血小板，结果显示，离心力为1 000 g获得的剩余血小板与1 500 g离心比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而离心力为3 000 g分离的剩余血小板显著低于1 500 g离心；离心力为500 g的剩余血小板显著高于1 500 g离心[5]。本研究使用常规离心条件获得PPP，进行凝血项目检测结果与标准离心条件下检测结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，与上述研究结果具有一致性。

本研究探讨提高离心速度缩短离心时间对凝血检测结果的影响。紧急情况下，常规凝血项目的检测时间不能满足临床急诊。本组将离心速度提高至3 600 r/min，离心时间缩短至5 min获得PPP进行凝血检测，结果表明该结果与标准离心条件下获得的凝血检测结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，是紧急情况下缩短TAT的有效、可行方法，与有关文献报道一致[6-7]。

根据CLSI建议，不同凝血检测项目对血浆中残存血小板的要求不同。PT和APTT检测低于200×109/L即可，而特殊类型凝血检测项目(蛋白S)则必须要求血浆中血小板浓度低于10×109/L。有研究显示，1次离心可满足常规凝血项目，而特殊类型项目则需要经过2次离心才能达到小于10×109/L[8]。有学者研究报道，离心机工作时加速键的“开”或者“关”也是影响PPP中剩余血小板的重要因素，建议凝血标本离心时选择“关”[9]。依据CLSI标准，普通凝血4项检测在常规离心条件下可达到要求。特殊类型项目需增加离心条件或者进行2次离心，达到合格。由于特殊类型项目的检测试剂昂贵，本组未进行检测结果比对，仅以离心后PPP水平验证离心效果。

某些患者血小板含量非常高，常规离心后是否能满足检测要求。本研究选取血小板含量不同的患者凝血标本，按常规及标准条件离心后，检测PPP中剩余血小板含量，结果显示，血小板(100～300)×109/L和(300～500)×109/L时，PPP中剩余血小板均在10×109/L以下，而当血小板高于500×109/L时，PPP中剩余血小板仅有64%小于10×109/L，有36%的标本离心后PPP中剩余血小板高于10×109/L，按标准条件离心后血小板全部低于10×109/L。因此对于常规凝血项目检测，用常规离心条件的PPP水平可接受，但如果是特殊类型凝血项目，如狼疮抗凝物检测等，则需要严格按照标准要求的离心条件进行离心，获得标准的、可满足检测的PPP[10]。

[1]Scridon A,Cerban RC.Laboratory monitoring:a turning point in the use of new oral anticoagulants[J].Ther Drug Monit,2016,38(1):12-21.

[2]D′audigier C,Delassasseigne C,Robert A,et al.Underestimation of plasma level of factor V coagulant activity and fibrinogen concentration together with prolonged prothrombin time,activated partial thromboplastin time and thrombin time can result from pre-analytical very low Calcium level in citrated sample tube[J].Int J Lab Hematol,2016,38(1):50-53.

[3]佟广辉，张晓平，佟威威，等．不同离心条件下对不同人群凝血常规检测结果的影响[J]．中华临床医师杂志(电子版)，2014，8(18)：3303-3306．

[4]Adocok DM,Hoefner DM,Koeeke-Marchant K,et al.Collection,transport,and processing of blood specimens for testing plasma-based coagulation assays and molecular hemostasis assaya:approved guideline,5th edn[M].PA:Clinical Laboratory Standards Institute,2008.

[5]Lippi G,Rossi R,Ippolito L,et al.Influence of residual platelet count on routine coagulation,factor Ⅷ,and factor IX testing in postfreeze-thaw samples[J].Semin Thromb Hemost,2013,39(7):834-839.

[6]Watanabe Y,Kawahara Y,Hanada D,et al.Examination of the sample centrifugation time for emergency coagulation test[J].Rinsho Byori,2012,60(11):1035-1039.

[7]王贞，靳岩，马晓露，等．改变离心条件制备乏血小板血浆凝血试验结果比较[J]．国际检验医学杂志，2013，34(19)：2589-2591．

[8]Suchsland J,Friedrich N,Grotevendt A,et al.Optimizing centrifugation of coagulation samples in laboratory automation[J].Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,2014,52(8):1187-1191.

[9]Daves M,Giacomuzzi K,Tagnin E,et al.Influence of centrifuge brake on residual platelet count and routine coagulation tests in citrated plasma[J].Blood Coagul Fibrinolysis,2014,25(3):292-295.

[10]Gosselin RC,Dwyre DW.Determining the effect of freezing on coagulation testing:comparison of results between fresh and once frozen-thawed plasma[J].Blood Coagul Fibrinolysis,2015,26(1):69-74.

Analysis the effect of different centrifugal conditions on the results of coagulation

MAXuebin，BAILu，ZHAOQiangyuan

(DepartmentofClinicalLaboratory,NavyPLAGeneralHospital,Beijing100048,China)

ObjectiveTo verify the effect of different centrifugal conditions on coagulation and ascertain the optimum centrifugal time for coagulation testing in the laboratory.MethodsNavy General hospital check-up and hospitalized patients were divided into three groups which were conventional group,standard group and speed up the group respectively according the different centrifugation conditions.The platelet poor plasma (PPP) was harvested in the three different groups.The PT,INR,FIB and APTT were tested and the results were compared and analyzed.Samples with different platelets were centrifuged in normal condition or standard condition,after that,the residual platelet in plasma was detected.ResultsThere was no significant difference of the PT,INR,FIB and APTT results among the routine group,speed group and the standard group.The results of PPP was qualified 100% in samples which platelets were less than 500×109/L with routine conditions and standards of centrifugal conditions.However,the qualified result of PPP was dropped to 64% in those samples which platelets were higher than 500×109/L with routine and standards of centrifugal conditions.ConclusionThe conventional centrifugation conditions can meet clinical routine coagulation testing requirements,the special types of coagulation assays or the samples which platelets count are more than 500×109/L should centrifuge in accordance with the requirements of the CLSI centrifugal processing.

coagulation testing;centrifugal conditions;platelet-poor plasma

马学斌,女,主管技师，主要从事凝血与血栓研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.005

A

1673-4130(2016)19-2672-03

2016-02-25

2016-04-20)