过氧化物酶催化聚合的应用进展

张丽华，蒋俊峰，田丽萍，李 江

(山西大同大学化学与环境工程学院，山西大同037009)

过氧化物酶催化聚合的应用进展

张丽华，蒋俊峰，田丽萍，李 江

(山西大同大学化学与环境工程学院，山西大同037009)

过氧化物酶属于生物酶的一个重要的组成部分，能够催化低分子量的有机物和无机物生成相关的聚合产物。它比一般的生物酶具有更高的选择性和催化效率，反应条件也比较温和，已被广泛的应用到科学研究、社会生产和社会生活的许多方面。本文综合概述了5种不同过氧化物酶的结构、催化机理以及它们在催化聚合方面的应用进展。

过氧化物酶；催化聚合；应用

有些酶在非水介质中同样具有较高的活性以及稳定性，能够催化生成一些常规方法难以合成的物质。过氧化物酶就是其中一种用途广泛的酶，根据来源不同将其分为3个基本的类型：动物过氧化物酶、植物过氧化物酶、真菌过氧化物酶。近来，随着研究的不断深入，人们又发现许多新兴的过氧化物酶。过氧化物酶可以在过氧化物如过氧化氢存在的环境下，催化多种化合物，被广泛应用于很多领域。本文主要介绍了辣根过氧化物酶、氯过氧化物酶、漆酶、锰过氧化物酶，木质素过氧化物酶的结构、催化机理以及它们在催化聚合方面的应用进展。

1 辣根过氧化物酶(HRP)

辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase)是一种含血红素的生物酶，是最先开始商品化生产、应用领域最宽、研究得最细致的植物过氧化物酶。在20世纪初就已经有人从辣根中将其提取出来，随后人们尝试将其固定化。它的催化活性高、耐热性强、对酸和碱的稳定性好，对污染物浓度以及盐度的耐受性较高，与抗原或者抗体进行偶联之后，酶活性损失很少，被广泛应用于医学、有机合成、环境保护等多个领域[1]。

1.1 辣根过氧化物酶的结构

HRP-C包含308个氨基酸残基，辅助基团为血红素，相对分子质量4.4×104，等电点范围3.0～9.0，通过测定其氨基酸的序列发现，HRP的N末端连有一个羧酸基团，而C的末端连接的丝氨酸易于离去，肽链中有4个二硫键，它们是由半胱氨酸组成[2]，结构如图1所示。

图1 HRP-C的结构

1.2 辣根过氧化物酶的催化机理

在H2O2存在下，HRP能催化聚合一系列的芳香胺、酚类[3]。通过研究，科学家认为，HRP的催化机理是以下的循环反应：

总反应式:2RH+H2O2→R-R+2H2O

1.3 辣根过氧化物酶催化聚合的应用进展

1.3.1 医学领域

2016年，Laura等[5]在过氧化氢存在的条件下，用辣根过氧化物酶催化金纳米棒引导配体的不均匀分布和选择性腐蚀。结果表明，在含硫有机物，如谷胱甘肽、硫代胆碱酶存在的情况下，金纳米棒蚀刻发生变形，这种效果能用来检测乙酰胆碱酯酶的活性，将疼痛产生的硫代胆碱催化分解。

1.3.2 有机合成

2014年，Sepa等人[6]将辣根过氧化物酶固定在硅纳米棒上，并用其催化甲苯聚合生成2,6-二甲基-1,4苯醚。固定化以后的酶活性显著增强，并且可以重复利用。2016年，Wang等[7]将辣根过氧化物酶、双氧水和乙酰丙酮成功地应用到催化淀粉聚合生成聚甲基丙烯酸甲酯的过程中。

1.3.3 污水处理

2015年，程龙[8]通过自发进行拼装以及反复的制备过程，把MWCNT（多壁碳纳米管）结合到堇青石上。得到了制备该复合载体的最佳方法：使用AEAPTS（硅烷偶联试剂）8-wt%，pH=3.5，T=50℃，使用MWCNT 0.5-wt%，并在150℃条件下真空干燥3次。将辣根过氧化物酶固定到该载体上，提高了酶活性和对环境的稳定性以及可反复利用性。之后将固定好的HRP用来处理含油的废水，油污的净化程度高达70%以上。

2 氯过氧化物酶(CPO)

氯过氧化物酶(Chloroperoxidase)兼多种过氧化物酶的催化性能，被广泛应用于医药生产、有机合成、染料降解等领域。氯过氧化物酶主要是从海洋真菌(Calderiomyces fumago)分离而来，电子接收体通常是过氧化氢类的物质。另外，CPO的空间选择性高，可以催化多种反应。如卤化反应、烯烃的环氧化反应等。

2.1 氯过氧化物酶的结构

CPO的相对分子质量约是42 kDa，等电点范围3.2～4.0，本质为糖蛋白酶。分子中有亚铁血红素，5%～30%的糖类物质，312个氨基酸残基基团，包括天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸等。CPO辅基的特征活性位点结构：血红素的近端配位基团与细胞色素P-450非常相似，第5轴位置以半胱氨酸(Cys29)中的硫来替换组氨酸的氮原子，远端的有效催化组分是谷氨酸(Glul83)[9]。CPO的活性位点结构如图2。

图2 CPO的活性位点结构

2.2 氯过氧化物酶的催化机理

初始的CPO活性中心包含铁卟啉环Fe3+，加入双氧水之后，双氧水发生异裂，血红素中的2个电子开始转移，氯过氧化物酶生成compound I和1个水分子，阳离子中间体compound I的稳定性差但是氧化性高[10]，能催化多种底物，具体催化机理如图3。

图3 CPO的催化机理

2.3 氯过氧化物酶催化聚合的应用进展

2.3.1 医药领域

2015年，李晓红[11]以氯过氧化物酶为催化剂、H2O2作氧化剂，处理了3类抗生素。结果显示，在适宜的条件下，pH维持在3～5的区间内；双氧水浓度约为(0.1～0.12 mmol/L-1)范围内；降解率可在10～20 min之内可高达100%，显示出相当诱人的前景。

这是从《全芳备祖》有关信息勾勒的大致经历，由于材料的稀缺，整个履历是极为模糊的。只能大致感觉到，他应属于当时的江湖游士一族，未见有科举、仕宦的任何信息，布衣终身，一生大部分时间都在江淮、湘赣、浙闽等地尤其是江淮之间漫游、客居。

2.3.2 有机合成

2012年，汪丽敏[12]对CPO催化二苯甲基硫代乙酰胺合成R-型莫达非尼的途径及其影响展开研究，还考察了添加剂对CPO催化活性的改变情况。实验结果：共溶剂能明显改善酶和底物的结合和酶的专一性，增大产物产率；GOD（葡萄糖氧化酶）氧化葡萄糖在线产生H2O2能将H2O2不断缓释到体系中，与常规的人工添加H2O2比较，能延长CPO保持活性的时间，产物的产率从32.4%增加至36.4%。

2.3.3 染料脱色

2014年，Jiao等[13]将氯过氧化物酶固定在孔状的二氧化硅材料上。由于二氧化硅载体具有只让少数的酶进入并且为CPO提供足够大的空间的优良性质，从而利于酶充分发挥催化效力。随后，用固定后的CPO对含氮染料进行脱色，效率高达90%以上。

3 漆酶

漆酶(Laccase)是一种呈现蓝色的多铜氧化酶。19世纪80年代初，吉田首次从漆树的漆液中分离出一种能够把漆催化固化的蛋白质。1894年，Ber⁃trand把它命名成漆酶。漆酶主要分布在真菌的分泌物当中，漆酶在污染治理、纺织、土壤的改良等方面发挥着不可替代的作用。

3.1 漆酶的结构特征

漆酶分子通常有4个铜原子，它们分布在3个结合位点中。漆酶可以使氧气还原成水。漆酶通常由500～600个氨基酸组成。每个酶分子由3个环状结构组成，呈球状结构[17]，如图4。

图4 漆酶的结构

3.2 漆酶的催化机理

漆酶可以将底物彻底催化，使羟基和氨基失去邻、对位活泼氢原子，从而将氧还原为水。漆酶有单电子，在催化历程中，底物结合到漆酶I型Cu2+位点上，经由半胱氨酸-组氨酸(Cys-His)再把电子转移到三核位点处，随后把电子传到氧分子，并使其还原为水[14]，机理如图5。

3.3 漆酶催化聚合的应用进展

3.3.1 医学领域

2010年，Zhang等[15]利用大伞杯漆酶对肿瘤和HIV反转录酶的活性进行抑制，结果表明，随着漆酶用量的提高，HepG2和MCF-7细胞生长都受到了抑制，抑制率分别是9.1%～80.5%和40.2%～95.4%，漆酶浓度是20 mmol/L时对HIV-RT的抑制率高达70.4%。漆酶还可以催化一些酚类物质生产抗菌素。

图5 漆酶的催化机理

3.3.2 有机合成

2010年，Polak等[16]用固定化的漆酶催化含有氨基和羟基的苯磺酸发生反应，最后得到的聚合物通常用来作为染料。2014年，López等[17]在漆酶的催化作用下，经过一系列反应过程将氟和甲氧基取代的酚聚合成具有发光能力的聚合产物，在摄影方面发挥重要作用。

3.3.3 污水处理

2014年，季万镇等人[18]将2,4-二氯苯酚(2,4-DCP)作为氯酚类物质的模型物，在曝气的环境下，探究白腐菌Trametes hirsuta BYBF产漆酶对2,4-DCP的处理效果：结果发现2,4-DCP的去除率随反应时间的延长而提高，当底物浓度是10 mmol/L，曝气20 h之后的去除率高达93.6%。2,4-DCP的去除效果同时受诸多原因的影响，纯化漆酶处理酚类物质的效果比粗漆酶要差一些。由于漆酶对温度和酸碱度的耐受性高，2013年，Zhang[19]等人用漆酶对污染水体进行生物修复除去污染物孔雀石绿。

4 锰过氧化物酶(MnP)

在20世纪80年代初，美国的研究人员最早从黄孢原毛皮革菌当中将锰过氧化物酶(Manganese peroxidase)分离提取出来。它能氧化各种芳香化合物，具有很高的工业应用价值，目前已知58种真菌能够产生锰过氧化物酶，多数为白腐真菌。

4.1 锰过氧化物酶的结构

锰过氧化物酶的结构中包含17%呈中性的糖类和众多呈酸性的氨基酸。血红素中只有1个可以与二价锰离子结合的位点，锰过氧化物酶能将二价锰离子氧化为三价锰离子，三价锰离子从过氧化物酶上脱离出来之后，若没有适合的物质与之结合，就会失去稳定性，生成二氧化锰[20]。

4.2 锰过氧化物酶的催化机理

MnP的反应链包含了Fe3+，以及活性中间体CompoundⅠ和CompoundⅡ。起初，酶与H2O2相互结合将血红素的电子传递给双氧水，使其还原为水，其他物质聚集成一个庞大中间体。然后将一个螯合的Mn2+作为电子给予体把MnP-CompoundⅠ还原成MnP-CompoundⅡ，Mn2+被氧化为Mn3+，进而MnP-CompoundⅡ被一个螯合的Mn2+还原到初始形态完成循环过程，生成2分子H2O。Mn3+与有机酸螯合形成非常稳定的氧化还原电势，螯合的Mn3+氧化酚类和有机酸。在高浓度的过氧化氢中MnP会很快失去活性[21]。见图6。

图6 锰过氧化物酶的催化机理

4.3 锰过氧化物酶催化聚合的应用进展

4.3.1 环境保护

2016年，张新宪[22]研究纯化后的SQ01锰过氧化物酶对10种联苯代谢产物的转化能力，并对产物的结构进行探讨。结果得知，锰过氧化物酶可以将联苯以及同系物进行转化，而这些物质在通常情况下难以被其他物质催化分解。该项研究为处理污水中的联苯类有毒物质提供了新的途径。2016年，Msgh⁃er等[23]从不同来源的云芝当中将锰过氧化物酶提取出来并对其性质进行考察，得到了酶活性最高的pH和温度条件，用锰过氧化物酶催化不同的染料以及酚类有机物降解，都取得了令人满意的结果。

4.3.2 造纸工业

2015年，唐瑶等[24]用锰过氧化物酶催化纸浆中的木素进行分解，经过处理之后纸张各方面的性质都有所改观，同时还能减少造纸过程中所用的能源，除此之外，研究了锰过氧化物酶对造纸产生的黑色废液的脱色降解效果。

4.3.3 染料脱色

2015年，郑苗苗等[25]用锰过氧化物酶对4种不同染料的脱色情况进行研究，结果发现对4种染料的脱色情况各异，其中对染料番红的脱色能力最强。2010年，吕聪[26]用MnP催化染料刚果红降解脱色，最佳脱色条件如下：过氧化氢添加量为0.15 mmol/L，T=40℃，pH=5.5，用茯苓在液体发酵环境下得到的MnP来降解脱色染料结晶紫，最佳脱色条件为过氧化氢浓度0.15 mmol/L，T=40℃，pH=5.0。

5 木质素过氧化物酶(LiP)

木质素过氧化酶(Lignin peroxidase)是一种非生长的次生代谢产物。对木质素类具有很强的降解能力，利用优化的营养物质通过固定化能将其批量生产。经过纯化后能氧化多种基质参加反应从而降解污染物，在工业三废的处理、土壤修复等工作具中至关重要。

5.1 木质素过氧化物酶的结构

木质素过氧化物酶相对分子质量在36～45 kDa。纯化后在40 kDa左右。最佳酶活性温度在35～55℃之间，最佳pH范围在2～5之间，氧化还原电位1.5 V[27]。

5.2 木质素过氧化物酶的催化机理

LiP是一系列含三价铁离子、卟啉环和血红素辅基的同工酶，可利用过氧化氢以及其他有机过氧化物催化一系列底物。LiP能把多电子单体氧化成自由基，同时从底物苯环夺取1个电子引发反应。化合物Ⅰ携带过氧化氢的2个氧化当量。其中一个是Fe4+-O中心，另一个则形成卟啉的阳离子自由基。化合物Ⅰ把基质R氧化成阳离子自由基，经过后来连锁的非酶反应得到产物。催化木质素侧链的Cα-Cβ链使其断裂将木质素降解[28]。见图7。

图7 木质素过氧化物酶的催化机理

5.3 木质素过氧化物酶催化聚合的应用进展

5.3.1 医学领域

2010年，毛亮等[29]探讨了LiP在不同环境中催化除去雌激素的效果，对反应物和产物的存在方式进行研究，对反应途径加以跟踪；同时分析了藜芦醇、天然有机物对该反应的影响；考察了反应过程中酶活性的改变以及酶的失活原理、预防酶变性失活的方法。2012年，Wang等[30]利用从白腐真菌中分离得到的木质素过氧化物酶催化除去5类内分泌干扰物p-t-辛基酚、雌激素、双酚A、17β-雌二醇、炔雌醇，去除效果非常明显。

5.3.2 染料降解

2010年，Sushama[31]通过离子交换法从侧孢芽孢杆菌将木质素过氧化物酶分离纯化，并利用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳提高酶活性。随后将其用于催化降解磺化偶氮染料甲基橙，取得了良好的降解效果。

5.3.3 环境保护

我国的畜牧业造成了严重的环境问题。2016年，Yan[32]利用木质素过氧化物酶对畜牧业产生的常见的8种污染物进行处理，结果对甲酚减少90%，吲哚化合物减少40%，气味强度下降将近60%，挥发性脂肪酸减少大约40%。2015年，Lamia等[33]利用木质素过氧化物酶对橄榄加工之后产生的有色废水进行脱色处理，同时对影响脱色效果的各种因素进行研究，将废水中的酚类物质催化分解，降低废水对环境的污染。

6 结语

过氧化物酶用于催化聚合的应用仍处于初级阶段，且过氧化物酶资源有限，价格昂贵，对催化机理和一些影响因素的研究也尚未明确。由于过氧化物酶本身结构的特殊性以及对环境的友好性，目前，已被广泛应用于医药、农业、工业、环境等各大领域。随着研究人员的不懈努力下，问题会迎刃而解，过氧化物酶的用途会更加广泛，过氧化物酶在催化聚合的应用前景更加诱人。

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Application of Peroxidase Catalytic Polymerization

ZHANG Li-hua,JIANG Jun-feng,TIAN Li-ping,LI Jiang
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Shanxi Datong University，Datong Shanxi,037009)

Peroxidase is one kind of enzyme,which can catalyze low molecular weight organic and inorganic substance’s polymer⁃ization to format the relative polymer.Peroxidase has better selectivity and catalytic efficiency than other enzyme,and it’s reaction con⁃dition is milder,therefore,it has been widely applied to scientific research,production and our daily life.This article summarized the research progress of five different kind of peroxidase’s structure,catalytic mechanism and application of catalytic polymerization.

peroxidase;catalytic polymerization;application

Q554+.6,X703

A

1674-0874(2016)05-0041-05

2016-05-25

张丽华(1981-)，女，山西大同人，硕士，实验师，研究方向：生物酶。

〔责任编辑 杨德兵〕