用血球计数板观察酵母菌种群密度实验要点解析

郭晴岚

摘 要 就血球计数板的规格、操作要点、计算方法以及血球计数板的优缺点做了简单的阐述，基本覆盖了高中生物必修3中“观察酵母菌种群数量变化”的实验操作时学生容易出现的失误和学生容易忽略的问题。

关键词 血球计数板 操作 酵母菌 菌液密度

中图分类号 G633.91 文献标志码 B

血球计数板是一种对人体红细胞、白细胞进行显微计数的工具，也常应用于观察计算一些体积略大的，呈分散分布的单细胞微生物的数量，它是一种常见的生物学器具。人民教育出版社出版的高中生物教材《必修3·环境与稳态》中，在探究酵母菌种群密度的实验里，明确要求应用血球计数板来观察酵母菌种群数量的变化，并要求学生在此基础上能够建构酵母菌种群数量增长的数学模型。所以，如何正确操作血球计数板并通过计算得到酵母菌种群的数量就成为这个探究实验成功的基础。

1 血球计数板的简介（XB.K.25型）

XB.K.25型血球计数板是由厚玻璃制成的，在正面由H形的凹槽将血球计数板分隔为上下两个同样的计数池。计数池两侧各有一支持柱，将血球计数板盖玻片（简称血盖片）覆盖其上，形成上下两个高为0.10 mm的计数池。每个计数池内均画有9个大方格，每个图中，中央大方格被双线分成25个中方格（位于正中及四角的5个中方格是血球计数板的计数区域），每个中方格用单线划分为16个小方格。至此，每个计数池中的中央大方格都包含400个小方格（图1）。

2 血球计数板的操作

我国现行的高中生物学教材中多没有很详细的血球计数板的操作过程介绍。如果没有教师的相应指导，学生很容易因为操作不当而导致失败。以下从容易失误的几个方面加以说明：

（1） 镜检计数室。因前一次清洗不到位，或者保存过程中存在污染，更或者因操作不当导致的计数室存在划痕，若不及时清洗或更换，则会对后期实验计数产生极大影响。所以，在每次使用血球计数板之前都需要加一步镜检计数室，如若在镜检时发现计数室有污物，则需按要求清洗并吹干后再进行实验。

（2） 摇匀后取液。未摇匀的情况下，酵母菌因比重较大都沉降在培养液的下方，若此时取液，会导致计数得到的酵母菌数量存在偏差。

（3） 先盖血盖片后加菌液。在菌悬液摇匀后，应先在血球计数板上盖上血盖片，再用滴管吸取少许菌悬液，从计数区中间平台沿血盖片的上边缘滴入一小滴菌悬液，利用液体的表面张力一次性充满计数区。若先加菌液再覆盖血盖片，则容易因为菌液加入过多，而导致血盖片未与血球计数板支持柱接触，血盖片浮于菌液上方而导致最后计数偏大，同时会因为有气泡产生而导致计数偏小。这个易错点不仅操作上经常出现，而且高考中也曾有所涉及，如2009年福建省的高考选择题中的一选项是“对酵母菌计数时，用吸管吸取培养液滴满血球计数板的计数室及其四周边缘，轻轻盖上盖玻片后即可镜检”。

（4） 静置片刻再计数。静置5 min，待菌悬液不再漂浮流动，酵母菌全部沉降后再将血球计数板放到显微镜下进行计数。先在低倍镜下找到需要观察计数的大方格及中方格，将中方格移到视野中央，然后拨动转换器移至高倍镜进行计数。

（5） 高倍镜下调亮度。低倍镜下，用平面镜和小光圈，可以清晰地看到血球计数板上的酵母菌。但是，拨动转换器换到高倍镜后，即使是用了平面镜和最小光圈，视野里往往还是白茫茫一片，什么都看不见，这时候可以尝试操作遮光器上的金属遮光片进行遮光处理。因为活的酵母菌和培养液的折光率相近，所以要在高倍镜下将视野调得暗一些。

（6） 掌握计数原则。在高倍镜下进行酵母菌的计数，对于压在方格界线上的酵母菌应当计数同侧的相邻两边上的菌体数，一般可采取“计上不计下，计左不计右，计上左两边的一个夹角”的原则处理，另两条边和三个角不计数。一般选择观察的菌液浓度控制在每个小方格内有4或5个酵母菌为宜，若酵母菌浓度太高，可适当稀释。若遇到酵母菌出芽生殖的情况，观察芽体，若芽体达到母细胞大小的一半时，即可作为2个菌体计数。计数一个样品要从一块血球计数板的2个计数室中计得的平均值来计算，对每个样品可计数3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），再取其平均值，由此来得出血球计数板上酵母菌的估算数量，从而进行种群密度的计算。

（7） 清洗血球计数板。血球计数板上有网格，所以切忌用刷子对其进行刷洗，应用流水冲洗，自然晾干或者吹风机吹干或者使用有机溶剂脱水使其干燥，并镜检合格后再放入配套的保存盒。

近年在高考或学业水平测试中，也时有涉及上述内容的试题出现。

3 利用血球计数板对酵母菌菌液密度的计算（XB.K.25型）

依据从5个中方格中计数得到的酵母菌数（计数需重复至少3次，取平均值），利用酵母菌（个数/mL）=5个中方格细胞总计数/5×25×10 000×稀释倍数 即可得到酵母菌菌液的密度。学生通过血球计数板的操作和计算，进一步增强了对生物学问题的理解，从而达到理论联系实际，并解决实际问题的要求，这方面的要求在近年的高考中也有体现，如：

2012年江苏省高考第27题：（2）③将样液稀释100倍，采用血球计数板（规格为1 mm × 1 mm × 0.1 mm）计数，观察到的计数室中细胞分布图（图2），则培养液中藻细胞的密度是 个/mL。（答案：108）

解析：因血球计数板规格为1 mm × 1 mm × 0.1 mm，所以应取四角和最中间5个中方格计数，依据计上不计下，计左不计右的原则处理，5个中方格内共有5+4+4+4+3=20个酵母菌，平均每个中方格内有4个酵母菌。计数区25个中方格，所以一共有4×25=100个酵母菌。计数区体积为1mm × 1mm × 0.1mm=0.1mm3=0.1×10-3mL，换算成1mL则有酵母菌100×104个，再乘以稀释倍数100，结果为108个/mL。

4 运用血球计数板计数的优势与局限

用血球计数板进行酵母菌种群数量的计数，其优点是显而易见的，如操作相对比较简单，耗时短，成本低，可重复性强。但缺点也很明显，利用血球计数板进行计数时，视野范围内无法区分细胞的死活，所以计数时，死的和活的细胞都计数在内，数值存在误差；对于一些体积较小的微生物，用血球计数板在高倍镜下也很难观察到，通常就需要选用价格更昂贵的细菌计数板或者使用油镜；血球计数板不适合用以观察和计数如放线菌等丝状微生物，也不能用于链状或不分散的微生物的观察等。