不同稀释液对藏猪精液4℃保存效果的影响

陈晓英 ，马金英 ，宋天增 ，唐建华 ，赵彦玲 ，任子利 ，朱彦宾 ，王良润

（1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009；2.西藏自治区畜牧总站，西藏 拉萨 850000；3.西藏农牧学院动物科学学院，西藏 林芝 860000；4.西藏牧乐农业科技有限公司，西藏 拉萨 850009）

不同稀释液对藏猪精液4℃保存效果的影响

陈晓英1，马金英1，宋天增1，唐建华2，赵彦玲3，任子利3，朱彦宾1，王良润4

（1.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009；2.西藏自治区畜牧总站，西藏 拉萨 850000；3.西藏农牧学院动物科学学院，西藏 林芝 860000；4.西藏牧乐农业科技有限公司，西藏 拉萨 850009）

为探讨不同精液稀释液对4℃保存藏猪精液的效果，保证优良藏猪种公猪精液的合理、高效利用，该试验选用5种常用的猪精液常温保存稀释液，并在藏猪精液4℃保存至第5天时检查藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率、精子质膜完整率等。结果表明，在精液保存过程中，2号液对藏猪精液的保存效果最佳，精子活力在保存至第5天时仍然保持在0.54，且藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率、精子质膜完整率均高于其余4组（P＜0.05）。该试验研究初步筛选了4℃保存藏猪精液的稀释液，为今后藏猪精液的生产应用奠定了基础。

稀释液；藏猪精液；4℃环境；精液品质

藏猪主要分布于雅鲁藏布江流域中游河谷区和藏东三江流域中游海拔为3 500 m左右的气候条件恶劣的高原地带，是我国唯一的高原猪种［1-2］。藏猪具有肉质优良、耐严寒、耐粗饲、抗逆性强等优点。为降低养猪成本，可用藏猪在抗病性和适应性等方面优良的遗传资源改良外种猪及其他地方猪的遗传结构［3］。

开展藏猪人工授精技术的应用不仅可以提高优良藏猪种公猪的利用率、提高母猪的受胎率和产仔数，而且可以减少种公猪的饲养头数，达到降低生产成本的目的。同时，还可以避免通过交配传播疾病，从而提高养猪生产的经济效益。猪精液的保存有液态保存和冷冻保存2种，目前在生产实践中应用的仍为液态保存中的常温［4］或冷藏保存。冷冻可长期保存猪的精液，但该技术因解冻后人工授精的受胎率很低［5］而无法推广应用。与冷冻精液相比，常规液态保存精液人工授精后具有受胎率高、窝产仔数高、费用低、操作程序简单等优点［6］。

近年来，随着猪人工授精技术的不断完善，其在集约化、规模化养猪场中的推广与应用愈来愈广泛。在高海拔地区，藏猪集约化、规模化程度较低，放牧饲养较多，为适应消费者对藏猪肉的大量需求和新建集约化藏猪养殖场对安全快繁技术的要求，藏猪精液的4℃保存技术和异地运输问题越来越受到重视。

为探讨不同精液稀释液对4℃保存藏猪精液的效果以及精液保存中一些基本参数的变化，保证优良藏猪种公猪精液的合理、高效利用，该试验选用5种目前较常用的猪精液常温保存稀释液对藏猪精液进行4℃保存，保存至第5天时检查藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率、精子质膜完整率等，探讨常温保存不同稀释液对藏猪精液4℃保存效果的影响，以期为藏猪精液的4℃保存技术和异地运输奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

1.1.1 实验动物与试验地点：实验藏猪为3～5岁健康种公猪6头。试验时间为2015年5—7月，地点在西藏工布江达县错高乡某藏猪养殖专业合作社、西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所和西藏农牧学院动物科学学院。

1.1.2 主要设备与试剂：动物电刺激采精仪（MDW-1，成都华智开物科技有限公司），倒置荧光显微镜（IX73，奥林巴斯），电热恒温水槽（DKB-450A，上海森信），变频冰箱（BCD-649WDVC，海尔）。

1～5号猪用精液稀释粉，由西藏牧乐农业科技有限公司提供。

新鲜藏猪精液，由西藏工布江达县错高乡某藏猪养殖专业合作社提供。

1.2 试验方法与内容

1.2.1 精液稀释液配制：按照说明书，将稀释粉按比例用双蒸水稀释，然后搅拌均匀，并用水浴锅加热至与精液等温，备用。

1.2.2 精液采集及处理：采用速眠新Ⅱ（0.1 mL/kg）肌肉注射麻醉健康藏猪种公猪，用动物电刺激采精仪于3 V、50 mA条件下电刺激法采集健康藏猪精液。

藏猪精液经滤纸过滤后保存于保温杯中，1 h内带回实验室。经过初步检查，选择色泽和气味正常，精子活率在 0.8 以上，密度为 3×108～5×108个/mL的精液用于试验研究。

1.2.3 精子质量评价：精子活力和精子畸形率2项精液常规性状参照世界卫生组织（WHO）的标准［7］测定，具体方法如下：

精子活力：精液过滤后立即在显微镜下观察精子活力，采用百分制法，直线前进精子数占总精子数的百分比为精子活力。

精子畸形率：采用龙胆紫酒精溶液染色法，将精子涂片染色，在400倍显微镜下观察，计算不同视野500个精子中畸形精子所占的比例即为畸形率（取3次计算的平均值）。

精子顶体完整率和精子质膜完整率2项精液性状参照文献［8］进行评价：

精子顶体完整率：考马斯亮蓝R250染色法。精子质膜完整率：低渗肿胀试验（HOST）。

1.3 试验设计 将每次采集的精液分成3份，按照2∶1的比例缓慢将等温稀释液加入精液中，轻轻摇晃混匀。用6层以上纱布包裹后放入培养箱中，17℃平衡2 h后，放入冰箱4℃保存。每隔12 h摇动精液1次，保存至第5天时检查藏猪精子活力、精子畸形率、精子顶体完整率和精子质膜完整率。试验重复3次。

1.4 数据处理 所得试验数据用Excel进行前期处理，再用SPSS 11.5软件进行One-way ANOVA方差分析，并进行多重比较，试验结果用“平均数±标准差”表示，检验误差为5%和1%。

2 结果与分析

2.1 不同稀释液对藏猪精液4℃保存精子活力的影响 第5天时，不同稀释液对藏猪精液4℃保存精子活力的影响见图1。由图1可以看出，用2号精液稀释液保存藏猪精液4℃保存到第5天时，藏猪精子活力最高，且显著高于其余4组（P＜0.05）。

图1 不同稀释液对藏猪精液4℃保存精子活力的影响

2.2 不同稀释液对藏猪精液4℃保存精子畸形率、精子顶体完整率和质膜完整率的影响 第5天时，不同稀释液对藏猪精液4℃保存精子畸形率、精子顶体完整率和精子质膜完整率的影响见表1。由表1可以看出，该试验选用5种不同稀释液研究在温度、稀释倍数等条件相同情况下保存猪精液，用2号稀释液的藏猪精液保存至第5天时，精子畸形率、精子顶体完整率、精子质膜完整率均高于其余4 组（P＜0.05）。

3 讨论

猪精液常温保存时，其稀释液成分对精液的保存效果至关重要。精液稀释后不仅可以扩大容积，还可以为精子代谢提供所需的能量物质［9-10］。因此，稀释液中含有营养物质、抗氧化剂、酶和激素等各种成分，能够维持或延长精子活率［11-16］。该试验选用5种不同稀释液研究在4℃、稀释倍数相同的条件下保存藏猪精液的效果，结果表明，2号稀释液的保存效果最好，精子活力在保存至5 d时还保持在0.54，藏猪精子畸形率、精子顶体完整率、精子质膜完整率等均高于其余4组（P＜0.05）。这5种稀释液均为进口产品，并未注明稀释液的具体成分，该研究只是根据说明书进行藏猪精液的稀释保存，旨在寻找适合于藏猪精液保存的稀释液，今后可在该基础上探索进一步改进方法，以提高藏猪精液的4℃保存技术和异地运输效果。

表1 不同稀释液对藏猪精液4℃保存精子畸形率、精子顶体完整率和精子质膜完整率的影响 %

4 结论

该研究初步找到了适合藏猪精液保存的稀释液，今后可在该基础上加以改进，以进一步提高藏猪精液的4℃保存技术和异地运输效果。

［1］强巴央宗，谢庄，田发益.高原藏猪现状与保种策略［J］.中国畜牧杂志，2001，37（6）：46-47.

［2］唐建华，冯静，陈晓英，等.藏猪种质资源保护与利用研究［J］.养猪，2016（1）：68-70.

［3］周琳，王蜀金.藏猪生理学研究进展［J］.家畜生态学报，2014，35（7）：7-12.

［4］凌培凤.猪精液液态保存长效稀释液的研制及其冷冻保存的研究［D］.天津：天津农学院，2014.

［5］YESTE M.Recent advances in boar sperm cryopreservation：State of the art and current perspectives［J］.Reprod Domest Anim，2015，50（Suppl 2）：71-79.

［6］高建明，虞桂平，邵世义，等.不同稀释液对猪精液常温保存效果的影响［J］.中国畜牧杂志，2007，43（13）：17-19.

［7］WHO.Laboratory Test Handbook about the Interaction between Semen and CervicalMucus ［M］.Beijing：Scientific Editor，1994：9-13.

［8］董伟，杨锁孝，王志清.猪精液在13～18℃下保存后受精能力的观察［J］.畜牧兽医学报，1964（1）：15-22.

［9］张宝珣，戈新，王建华，等.猪常温精液保存的研究进展［J］.猪业科学，2009（8）：68-71.

［10］胡建宏，刘玉，苏泽智，等.影响猪精液常温保存效果的因素分析［J］.畜牧与兽医，2013，45（12）：115-117.

［11］马乃祥.猪高效精液稀释液研究与应用效果评价［D］.海口：海南大学，2013.

［12］刘玉.猪常温精液稀释液配方的筛选与优化 ［D］.杨凌：西北农林科技大学，2013.

［13］张金玲，房灵军，田国宁，等.猪精液常温保存效果观察［J］.动物医学进展，2014，35（12）：110-114.

［14］王师哲.关中黑猪精液常温保存研究［D］.杨凌：西北农林科技大学，2014.

［15］苏泽智，李亚新，魏海燕，等.稀释粉对猪精液常温保存效果的研究［J］.家畜生态学报，2015，36（1）：59-62.

［16］卫帅毅.猪精液常温保存稀释粉保存效果研究［D］.杨凌：西北农林科技大学，2016.

Preservation Effect of Different Extenders on Tibetan Boar Semen at 4℃

CHEN Xiao-ying1，MA Jin-ying1，SONG Tian-zeng1，TANG Jian-hua2，ZHAO Yan-ling3，REN Zi-li3，ZHU Yan-bin1，WANG Liang-run4
（1.Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Lhasa 850009，China；2.Tibet Animal Husbandry Service Station，Lhasa 850000，China；3.Faculty of Animal Science，Tibet Agricultural and Animal Husbandry College，Nyingchi 860000，China；4.Tibet Mulo Agricultural Sciences and Technology Co.，Ltd.，Lhasa 850009，China）

This study was conducted to investigate the preservation effect of different extenders on Tibetan Boar semen at 4 ℃ and to provide scientific basis for reasonable and high-efficient utilization of excellent Tibetan Boar breeder semen.Five different extenders commonly used for preservation of Tibetan Boar semen in room temperature were selected.The sperm motility,sperm deformity rate，and the integrity rate of sperm acrosome and plasma membrane preserved by the five extenders at the 5thday of preservation period at 4℃were statistically evaluated and compared.The results revealed that the NO.2 extenders exhibited the best preservation effect with the sperm motility of 0.54 at the 5thday of preservation period,and the sperm motility,sperm deformity rate and the integrity rate of sperm acrosome and plasma membrane preserved with NO.2 extenders were higher than those of the semen preserved with the other four extenders （P＜0.05）.This study preliminary selected the appropriate extenders for Tibetan Boar semen used at 4℃and laid the foundation for the production and application of Tibetan Boar semen in the future.

extenders；Tibetan Boar semen；environment at 4 ℃；semen quality

S828.34

A文章顺序编号：1672-5190（2016）10-0022-03

2016-09-28

项目来源：西藏自治区2016年高校青年教师创新支持计划项目（QCZ2016-47）；院（校）企合作技术开发项目（YXQ2015ZZ-01）；西藏自治区2016年农林业科技成果转化与推广（农牧业技术推广）项目“特色畜禽（藏猪）营养调控研究”。

陈晓英（1981—），女，助理研究员，硕士，主要从事高原畜禽繁殖技术研究工作。

宋天增（1980—），男，助理研究员，硕士，主要研究方向为动物繁殖营养调控与遗传育种。

（责任编辑：慕宗杰）