胞外捕获器：固有免疫细胞第三种防御机制的研究进展

廖成水，Boireau Pascal，刘明远，程相朝

(1.河南科技大学，动物疫病与公共安全重点实验室/河南省动物疫病与公共安全院士工作站，洛阳 471003；2.ANSES，Laboratory for Animal Health，Maisons-Alfort 94706；3.吉林大学，人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室，长春 130062)



胞外捕获器：固有免疫细胞第三种防御机制的研究进展

廖成水1，3，Boireau Pascal2，刘明远3，程相朝1*

(1.河南科技大学，动物疫病与公共安全重点实验室/河南省动物疫病与公共安全院士工作站，洛阳 471003；2.ANSES，Laboratory for Animal Health，Maisons-Alfort 94706；3.吉林大学，人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室，长春 130062)

胞外捕获器(extracellular traps，ETs)的释放是近来新发现的一种由DNA和颗粒蛋白组成的固有免疫防御机制。作为继吞噬作用、自噬之后的第三种杀伤机制，大量的研究已经证实ETs在体内外可捕获和杀伤绝大多数的细菌、病毒、真菌和寄生虫，作者对ETs的概念、形成的分子机制以及ETs在宿主防御中的作用进行了简要的介绍，这将对固有免疫细胞防御策略的新认识具有重要的意义。

固有免疫细胞；胞外捕获器；外捕作用；杀菌活性

固有免疫细胞是机体固有免疫系统的一个重要组成部分，是生物体在长期种系进化过程中形成的一系列免疫效应细胞。一直以来，吞噬作用被认为是固有免疫细胞经典的防御机制[1]，细菌、病毒、损伤的细胞以及衰老的红细胞等有害物质吞入细胞后形成吞噬小体，吞噬小体与溶酶体融合后通过酶的消化作用降解这些有害物质。除了经典的吞噬杀伤机制，自噬作用也被证实是固有免疫细胞的第二种防御机制，自噬作用可以清除侵入宿主细胞的革兰阳性胞内菌、兼性胞内菌、病毒和胞内寄生虫等病原体[2]。2004年，德国科学家V.Brinkmann等发现了中性粒细胞新的杀伤机制，并将其命名为中性粒细胞胞外捕获器(neutrophil extracellular traps，NETs)[3]，这是一个足以载入史册的里程碑式的发现，使得人们对宿主固有免疫细胞防御功能的传统观念发生了改变，对免疫细胞的认识和研究进入了一个全新领域。

1　中性粒细胞胞外捕获器与外捕作用

中性粒细胞是机体中数量最多的一种白细胞，中性粒细胞含有髓过氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性水解酶等多种颗粒蛋白成分，在炎症和宿主防御方面起着重要的作用。很长一段时间内，普遍认为中性粒细胞主要通过募集、吞噬以及NADPH氧化爆发和毒性蛋白发挥杀菌功能。然而，2004年，V.Brinkmann等首次发现了颠覆传统的中性粒细胞杀菌机制，即人和小鼠中性粒细胞被1，2-丙二醇单甲醚乙酸酯(1，2-propylene glycol monomethyl ether acetate，PMA)、LPS、IL-8和血小板以及革兰阳性菌和革兰阴性菌等外源物质刺激后向胞外释放一些网状结构物质[3]，他们把这种网状物质称为NETs。NETs主要由两部分构成：DNA和抗菌分子，以DNA为主骨架，抗菌分子包括来源于细胞核的组蛋白(H1、H2a、H2b、H3和H4)、一级嗜苯胺蓝颗粒(中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、髓过氧化物酶、细菌通透性增加蛋白、蛋白酶和防御素)、二级特殊颗粒(乳铁蛋白、Cathelicidin LL37抗菌肽和正五聚蛋白3)和三级颗粒(明胶酶和肽聚糖识别蛋白)[4]。

如图1所示，NET的形成过程大致可以描述为：受刺激中性粒细胞细胞核染色质解聚，随后细胞核特有形状消失。紧接着核膜内囊泡形成，加剧核膜的分解。同时，细胞质中的颗粒膜分解促进染色质和颗粒内容物穿过破裂的细胞膜泄漏至细胞质。最终细胞膜破裂，DNA与颗粒物的结合产物一起抛至细胞外环境中[5-6]。将细胞NETs形成的这个过程称为中性粒细胞外捕作用(NETosis)，并且已证明了它是一种不同于凋亡和坏死的程序性细胞死亡方式。DNA片段化或细胞膜外暴露的磷脂酰丝氨酸是细胞凋亡的显著特征，而NETosis形成与这些现象无关。与凋亡和坏死的另一个不同特征是NETosis形成时细胞核膜和颗粒膜均破裂。自NET发现以来NETs形成被认为是细胞死亡的一种新形式，但新近的一项研究显示体内中性粒细胞不因释放NETs而发生溶解，仍然保持着移动和吞噬活性[7]，这表明NETs形成后细胞并未死亡，但这种现象仍有待于进一步研究。由于ETs这种胞外结构首先在中性粒细胞中发现，目前大部分关于ETs的研究都是围绕中性粒细胞展开，因此，一开始将ETs形成的细胞死亡现象称为NETosis，而随后对ETs研究发现ETs现象广泛存在于其他固有免疫细胞，从而将ETs形成的这个过程扩展为外捕作用(ETosis)[6]。

2　多种细胞形成胞外捕获器参与免疫防御

自NETs杀伤机制被报道之后，大量的研究发现ETs并不是中性粒细胞所特有的现象，这种杀伤机制同样也存在于肥大细胞[8]、嗜酸性粒细胞[9]、嗜碱性粒细胞[10]和巨噬细胞/单核细胞[11]以及鸡异嗜白细胞[12]、河虾白细胞等其他类型先天性免疫细胞。同时，ETs现象不仅局限于人和小鼠免疫细胞，而且马、猫、牛、鱼、无脊椎动物和植物细胞也可以释放ETs。这些不同类型细胞受多种分子、微生物和微生物产物刺激后能够产生ETs。有报道指出，由类绛色细胞释放细胞外核酸是针对昆虫病原微生物的一个重要的防御机制[13]。因为不同的细胞类型都能释放DNA到细胞外环境，因此ETs被认为是一个普遍防御机制。不同类型细胞释放ETs的共同特征是具有由抗菌多肽、蛋白酶和组蛋白等修饰的DNA构成的主骨架[14]。

3　胞外捕获器形成的分子机制

尽管目前对ETs的相关研究已经取得了显著的进展(图2)，然而ETs形成的确切分子机制仍没有得到完全阐明。但普遍认为ROS的生成和NADPH氧化酶的活性是参与ETs形成和ETosis的重要关键因素[15]。PMA属于蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)酶家族合成的激活剂，是一种诱导ETosis最常使用的化合物。PKC直接激活NADPH氧化酶和ROS的产生。抑制NADPH氧化酶后发现中性粒细胞生成ETs的能力显著下降，这体现了NADPH氧化酶在ETs释放中的重要性[16]。慢性肉芽肿病(chronic granulomatous disease，CGD)患者由于NADPH氧化酶功能缺陷，因而从患者体内提取的中性粒细胞在体外无法形成ETs[17]，而添加外源过氧化物后CGD患者中性粒细胞重新形成NETs。N-乙酰半胱氨酸、氯化二亚苯基碘鎓和6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸等ROS清除剂对NETosis的抑制作用与ROS产生量一致[18]。虽然这些研究资料充分说明了ROS在ETs形成的重要作用，但ROS是如何促进ETosis形成尚不清楚。其中一种可能性是ETosis形成期间ROS可使半胱氨酸蛋白酶失活，这些物质直接改变中性粒细胞形态学[18]。

图1　固有免疫细胞释放ETsFig.1　ETs formation in innate immune cells

图2　固有免疫细胞释放ETs的分子机制Fig.2　Mechanisms of ETs formation in innate immune cells

研究报道指出，Rac2是NETosis信号转导过程中的一个重要因子。gp91phox经PKC磷酸化作用后结合细胞质和细胞膜NADPH氧化酶亚基形成一个ROS的功能性复合体[19]。Rac1缺陷的中性粒细胞和野生型中性粒细胞受到PMA或LPS刺激后可释放等量的NETs，然而Rac2缺陷的中性粒细胞不能形成一个功能性酶复合体，从而丧失形成NETs的能力[18]。此外，超氧化物进一步转换为过氧化氢和高氯酸是NETs释放过程所必需的一步。尽管在ETs形成过程中ROS的生成和NADPH氧化酶的活性被认为是至关重要的，但也有报道称，某些条件下通过非ROS依赖途径也可能发生NETosis[20-21]，如金黄色葡萄球菌[22]或杜氏利什曼原虫[23]等微生物可通过够独立于ROS的分子过程释放ETs。

ETosis形成是一个多因素的过程，仅通过NADPH氧化酶活性并不足以触发这个过程。组蛋白肽基精氨酸脱亚胺酶4(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)依赖的组蛋白H3瓜氨酸化亦是ETs形成的关键(图2)。PAD4缺陷的小鼠中性粒细胞在体外丧失了形成NETs的能力[24]。添加毒胡萝卜素可增加细胞内Ca2+水平，增加的Ca2+水平可激活Ca2+-依赖的PAD4活性，导致组蛋白瓜氨酸化，这构成ETs形成中的下游信号传导过程[25]，从而诱导中性粒细胞形成ETs[26]。PAD4脱氨基作用是由炎症或感染性刺激引起NETs的一个主要翻译后修饰现象[25]。

虽然肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞产生ETs的分子机制与NETs有一些相似之处，但不同的细胞类型产生的ETs也表现出一定的差异，例如ETs形成的启动机制、DNA骨架来源(细胞核或线粒体)、应答细胞的比例及ETs释放量和释放时间等。中性粒细胞ETs骨架DNA来源于细胞核染色质，嗜酸性粒细胞ETs骨架DNA来源于线粒体DNA，而嗜碱性粒细胞和巨噬细胞ETs骨架DNA同时来源于细胞核染色质和线粒体DNA。嗜碱性粒细胞ETs依赖于ROS的生成，而不依赖于NADPH氧化酶的活性[27]。中性粒细胞ETs形成过程中颗粒蛋白在细胞内与细胞核染色质结合后一起释放至细胞外环境，这些颗粒蛋白以游离形式结合至骨架DNA上，而嗜酸性粒细胞ETs形成过程中颗粒蛋白以完整的形式结合至骨架DNA[28]。

4　胞外捕获器在宿主防御中的作用

虽然ETs捕获或杀伤病原微生物的分子机制并未完全阐明，但大量的研究已经证实了ETs可捕获和杀死多种细菌、病毒、真菌和寄生虫。因此，ETs在宿主防御中作用包括捕获以及直接杀死病原微生物两个方面。

4.1诱捕病原微生物

ETs所展现的第一步抗菌活性是通过物理黏附来完成，ETs结构的阳离子和细菌表面的阴离子之间的静电相互作用促使ETs形成捕获能力[29]。利用电子扫描显微镜和免疫荧光显微镜等直接成像系统证实了ETosis形成后胞外DNA具有黏附肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和弗氏志贺菌等多种不同病原体的能力[3，20，22]。虽然大量的资料证明了细菌可黏附于胞外DNA，但是这些高清成像试验并不能百分之百确定NETs捕获细菌，也有可能是细菌主动附着胞外DNA骨架上。为了支持捕获假说，在体外利用流式小室系统证明了在生理调节下和正常血流速度下NETs能捕获大肠杆菌。肝活体显微镜检测显示NETs在体内可捕获大肠杆菌[30]。此外，在体内肺炎克雷伯杆菌感染的小鼠肺部中可见NETs捕获的细菌[18]。

利用高速双转盘活体共聚焦显微镜分析更为清晰地观察到内毒素血症肝NETs捕获情况，NETs释放入肝窦从而捕获循环中的大肠杆菌，从而防止其进一步扩散[31]。利用细菌培养和分布模型非成像试验间接支持NETs在捕获细菌中的作用。真菌感染在中性粒细胞免疫缺陷的患者中是非常常见的，由于吞噬作用对于这些病原体无效，捕获作用就显得更为重要。利用扫描电子显微镜和共聚焦显微镜可观察到白色念珠菌黏附于NETs结构[32]，证明NETs可捕获白色念珠菌[32-33]。利用免疫荧光和扫描电子显微镜体外以及双光子显微镜在活体肺组织证实了NETs可捕获烟曲霉[34]。虽然观察到ETs捕获真菌的现象，但怎样有效结合并捕获如此大的微生物仍然不清楚。胞外DNA骨架可能具有发挥直接捕获功能，但有学者提出表面活性剂蛋白D和C型凝集素结合模式识别受体通过形成一个中间桥是结合病原菌和NETs的另一作用方式[35]。体内试验显示，迁移的中性粒细胞释放NETs覆盖整个组织区域，从而形成了一个庞大的网状捕获结构以阻止细菌扩散至血管或者淋巴管。由于具有DNA结合位点的纤维结合蛋白在组织间质中高表达，使得NETs广泛分布于组织中。这同样可以解释为何在体内观察到一大片DNA，而在体外常以丝状形式存在。

4.2杀菌活性

ETs可通过捕获作用限制病原体在体内进一步扩散，但ETs是否具有直接杀伤病原体的能力是科研工作者所关心的重要问题。由于ETs主要组成成分包括组蛋白、DNA以及免疫细胞颗粒蛋白，而颗粒蛋白、组蛋白和DNA是重要的抗微生物分子，因此可以推论出这些结构具有直接杀伤微生物的能力。早在数十年前科研工作者就发现了组蛋白的抗菌特性[36]，但当时并未阐明这些蛋白质在细胞核外环境中的杀菌功能。同样地，利用细胞松弛素D抑制中性粒细胞吞噬作用后，中性粒细胞仍然展现出杀菌活性，而同时添加外源DNase或者抗组蛋白H2A抗体以抑制ETs形成后无法观察到杀菌活性[3]。这项研究间接表明中性粒细胞吞噬作用受到抑制后可通过ETs发挥杀菌能力。

增加某些抗微生物肽的局部浓度可能是ETs杀灭病原体的一个重要方式，DNA骨架聚集了高浓度的抗菌分子，增强了抗菌分子杀伤微生物的效率[8]。组蛋白是ETs中具有抗微生物特性的物质。从各种生物体和不同类型细胞中分离得到的组蛋白和组蛋白相关肽表现出广谱抗菌活性[4]，特别是组蛋白H2B对革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌的抗微生物性质[37]。除了组蛋白，黏附于DNA骨架上的免疫细胞颗粒蛋白同样具有抗微生物作用。哺乳动物中两种最重要的抗菌肽家族是防御素[38]和cathelicidins抗菌肽[39]。Cathelicidins属于一个抗微生物肽家族，存在于中性粒细胞、肥大细胞和巨噬细胞等免疫细胞溶酶体中[40]。研究证实中性粒细胞和肥大细胞产生的ETs中存在cathelicidins抗菌肽[3，8]。然而，随之而来的问题是抗菌肽黏附到胞外ETs的DNA骨架后是否仍保留着抗菌活性。NETs可能也具有调理某些真菌的功能，如NETs通过远古抗体穿透素PTX3调理烟曲霉[41]。PMA刺激PMN产生的NETs可通过钙卫蛋白的锌螯合作用抑制曲霉的生长[16]。PMA诱导的NETs同样具有杀灭白色念珠菌的能力，这个杀伤机制与DNA和钙网蛋白有关，但与组蛋白无关[32，42]。NETs的阳离子螯合作用同样可能有助于杀伤条件性病原体，如假单胞菌[43]。

但是其他研究团队并没有证明NETs具有明显的直接杀伤能力。由于没有办法在不影响中性粒细胞其他机制下直接抑制NETs形成，因此很难推断NETs的杀菌作用。尽管可以清晰地观察到NETs捕获金黄色葡萄球菌，但DNase处理后释放的活菌依然具有增殖能力[44]，这表明被捕获的细菌未被杀死。向DNA骨架添加毒性抗菌颗粒蛋白酶证明了NETs的直接杀伤活性。但是在1980年晚期和1990年早期一系列研究很好地证明了中性粒细胞蛋白酶必须在一个游离空间才具有活性[45-46]。由于血浆中含有大量的α1-蛋白酶抑制因子活性，1 mL血浆可灭活5×108个中性粒细胞的弹性蛋白酶。那么，NETs形成释放的弹性蛋白酶怎么维持其蛋白水解和抗菌活性依然不清楚，其中一个可能性就是在某种条件下骨架DNA结构可保护弹性蛋白酶。A.McCormic等指出单独依赖NETs机制并不能完全杀伤烟曲霉[47]，但它们可能减少菌体的极性生长[34]。

5　展　望

尽管对于ETs已经进行了大量研究并有所进展，但ETs形成的具体机制仍然没有得到完全阐明，ETs这个进化保守的古老免疫新机制的许多性质和意义方面值得进一步详细探索。尤其是cathelicidins或组蛋白等抗微生物活性成分的作用仍在研究和讨论中。镶嵌于DNA主骨架上的这些分子可以多大程度上发挥其生物功能也不得而知。本课题组在研究巨噬细胞METs时发现这种胞外网状结构物质对于大肠杆菌和白色念珠菌表现出一定的杀伤效应，但与其他研究相比这种杀伤作用显得不那么明显[11]。另一个值得关心的问题是为什么只有一部分细胞可以释放ETs，这一点有悖于ETs在这些细胞的功能生物学中的主要作用。因此，未来的研究方向首先是解决研究中的限制性因素，阐明ETs形成的详细信号通路，进一步分析ETosis的调节机制，怎样抑制和控制这些信号通路并为疾病治疗提供靶向。

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(编辑白永平)

Research Progress on Extracellular Traps：the Third kinds of Defence Mechanisms of Innate Immune Cells

LIAO Cheng-shui1，3，BOIREAU Pascal2，LIU Ming-yuan3，CHENG Xiang-chao1*

(1.AnimalDiseaseandPublicSecurityAcademicianWorkstationofHenanProvince/TheKeyLabofAnimalDiseaseandPublicHealth，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China；2.LaboratoryforAnimalHealth，ANSES，Maisons-Alfort94706，France；3.KeyLaboratoryofZoonisisofMinistryofEducation，InstituteofZoonosis，JilinUniversity，Changchun130062，China)

Extracellular traps (ETs)，composed of DNA and granular proteins，act as a sort of new innate immune phagocytosis-independent extracellular defense mechanism which was discovered in recent years.As the third killing mechanisms of innate immune cells after phagocytosis and autophagocytosis，ETs can ensnare varied kinds of invading microbes inducing bacteria，virus，fungi，and protozoa to prevent local diffusion and kill theminvitro，and alsoinvivo.In this review，we will briefly describe the recent progress of the concept and molecular mechanism of ETs，and its role in host defense.This review has substantial significance on the new understanding of defense strategy in innate immune cells.

innate immune cells；extracellular traps；ETosis；bactericidal activity

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.004

2016-04-20

国家自然科学基金重点项目(31030064)；国家自然科学基金面上项目(31572489)；河南科技大学博士启动基金项目(13480071)；河南科技大学青年科学基金资助项目(2015QN033)

廖成水(1986-)，男，福建长汀人,副教授，博士，主要从事微生物感染与先天性免疫细胞作用研究，E-mail：liaochengshui33@163.com

程相朝，教授，主要从事动物疫病分子与免疫学机制研究，E-mail：chengxch@126.com

S852.42

A

0366-6964(2016)09-1768-07