2个印记的基因间lncRNAs位于牛Dlk1-Dio3印记区域

杨文志，张明月，王冠楠，赵宇鹏，张巍巍，李世杰*

(1.河北农业大学生命科学学院，保定 071001；2.河北北方学院，张家口 075000)



2个印记的基因间lncRNAs位于牛Dlk1-Dio3印记区域

杨文志1，张明月1，王冠楠1，赵宇鹏2，张巍巍1，李世杰1*

(1.河北农业大学生命科学学院，保定 071001；2.河北北方学院，张家口 075000)

旨在鉴别牛Dlk1-Dio3印记区域内的新印记lncRNAs。本研究选取位于Meg8与Meg9基因间的2组表达序列标签(EST)，通过RT-PCR克隆序列并进行分析，结果发现其具有lncRNA的特征，命名为Linc24062和Linc24063。分析Linc24062和Linc24063在牛8个组织(心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、皮下脂肪和大脑)中的表达，发现2个lncRNAs在被检测的组织中均表达。利用基于单核苷酸多态性(SNP)位点的直接测序法，通过比较杂合子牛中SNP位点处基因组PCR扩增产物与RT-PCR扩增产物的测序峰图分析Linc24062和Linc24063的印记状态，发现Linc24062和Linc24063在牛被检测组织中均为单等位基因表达，说明Linc24062和Linc24063在牛中是印记的。

基因组印记；基因间长非编码RNA；Dlk1-Dio3印记域；单核苷酸多态性；牛

基因组印记(Genomic imprinting)是一种表观遗传(Epigenetic)现象，是指在哺乳动物早期配子发生过程中接近1%的蛋白编码基因经过表观遗传标记，从而使基因的表达具有亲本特异性[1]。绝大多数哺乳动物的基因组都可以转录成长非编码RNA[2-4]。LncRNAs作为长度大于200 bp的一类非编码蛋白的RNA，通过与靶基因或其启动子重叠[5]或通过对染色质表观遗传标记进行修饰[6]建立靶基因的印记而发挥重要的生物功能。印记基因通常成簇存在，位于印记基因簇里的lncRNAs，通常具有亲本等位基因特异性表达的特点。Dlk1-Dio3印记区域由于在胚胎发育和细胞分化过程中的重要作用而备受关注，是目前研究比较充分的印记区域之一。其中位于Dlk1-Dio3印记域内母源等位基因特异性表达的非编码RNA被鉴定与诱导全能干细胞发育的全能性有关[7-8]。一些位于两个基因间的长非编码RNA，被称为基因间长非编码RNA(Intergenetic long noncodng RNA，lincRNA)。近来在鼠Dlk1-Dio3印记域的印记基因Meg8与Meg9及Meg9与Dio3之间分别发现了1个新的长非编码RNAB830012L14Rik和AK044800[9-10]。在鼠中，基因间长非编码RNAB830012L14Rik被鉴定为母源特异性表达印记基因，且主要在大脑、心、肺和肝组织中表达[9]。而AK044800主要在小鼠胚胎发育时期前脑组织中表达，在脑中AK044800为双等位基因表达[10]。对牛的Meg8与Meg9基因的可变剪切体，印记状态及表达模式进行分析[11-12]。随着转录组测序的进行，一些未知功能的EST序列定位在牛Dlk1-Dio3印记区域。本研究旨在牛Dlk1-Dio3印记域Meg8与Meg9基因间区域鉴别新的lincRNAs，并对其印记状态及表达模式进行分析。

1　材料与方法

1.1试验材料

试验用动物样品取自当地屠宰场，32头成年的荷斯坦奶牛(Holstein)屠宰后，立即采取每个个体的组织样品，包括心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、皮下脂肪、大脑等组织，装入编号的采样袋中，立即投入液氮，-70 ℃保存，以备后续试验使用。

1.2RNA的提取及反转录

利用Trizol RNA提取试剂盒(Invitrogen，美国)提取总RNA，用无RNA酶的DNaseⅠ去除可能的DNA污染。利用TransGen反转录试剂盒(全式金，中国)进行cDNA的合成。20 μL反应体系中含有大约1 μg的RNA，1 μL的Oligo(dT)引物，10 μL 2×ES Reaction Mix，1 μL RT Enzyme Mix，用无RNA酶的水补齐。反转录反应程序按厂家提供的产品说明书进行，总RNA、Oligo(dT)引物、无RNA酶水加好后轻轻混匀，65 ℃变性10 min，打开RNA二级结构，然后在每个反应体系中加入2×ES Reaction Mix 和RT Enzyme Mix，42 ℃孵育30 min，85 ℃保温5 min，终止反应，-20 ℃保存待用。

1.3RT-PCR 及Linc24062和Linc24063的克隆

在牛的Dlk1-Dio3印记域内，为发现新的印记基因，用UCSC Genome Browser (http：//genome.ucsc.edu/) Blat对Meg8与Meg9基因间的表达序列进行了仔细的搜索分析，鉴别出6个EST序列。一些EST序列与其他EST部分重叠，而一些EST没有重叠但所处位置很近，所以推测它们可能是同一基因的一部分。为证明此猜想，根据EST序列用Primer5设计对应的引物，用F1 (5′-CAGCTCCGATGGGGAT-3′) 和R1 (5′-GTTAGTCTTTTTGTTAGGCAG-3′)，F2(5′-CTTCAGATTGCTGTGGGA-3′)和R2 (5′-GGAGTTGGTGATGGGC-3′) 扩增来源于试验动物各组织的cDNA，分别克隆Linc24062和Linc24063。利用1对跨内含子的引物Gap-F (5′-GCACAGTCAAGGCAGAGAAC-3′)和Gap-R (5′-GTGGCAGTGATGGTGGA-3′) 扩增一段375 bp大小的GAPDH(Accession No.:BTU85042)片段作内参。反应体系(25 μL)：上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，1 μL cDNA模板，2 μL dNTP(2.5 mmol·L-1)，2.5 μL 10×LA Taq Buffer，0.2 μL LA Taq DNA polymerase(宝生物，中国)，18.3 μL双蒸水。RT-PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用E.Z.N.A.Gel-胶回收试剂盒(Omega，美国)纯化回收，克隆到PMD18-T载体(宝生物，中国)上，送华大基因公司测序。

1.4DNA的提取及SNP的鉴定

利用DNA提取试剂盒(生工，中国)提取32头荷斯坦奶牛的肝组织DNA。引物F1和R1，F2和R2分别用于扩增Linc24062和Linc24063基因844和754 bp大小的DNA片段，PCR反应体系(25 μL)：上下游引物(10 μmol ·L-1)各1 μL，1 μL DNA模板，9.5 μL双蒸水和12.5 μL ES Tap Master Mix (康为，中国)。PCR反应条件与RT-PCR相同，扩增产物进行胶回收并直接送测序验证。利用Chromas软件查看测序图谱，若存在有效重叠峰则确定该个体为杂合子。

1.5Linc24062和Linc24063的印记状态分析

从32头牛中鉴定的杂合子被用于等位基因特异的表达状态分析。将杂合子牛的RNA 反转录成cDNA，以cDNA为模板，用F1和R1、F2和R2分别为引物扩增Linc24062和Linc24063的目的片段。PCR反应体系和反应条件与SNP鉴定过程相同，扩增产物进行胶回收并直接送测序。

2　结　果

2.1Linc24062和Linc24063是位于Meg8与Meg9基因间非编码RNA

通过对Meg8与Meg9基因间的表达序列进行搜索，发现4个序列重叠的ESTs(DY146989、CB436087、CB426809和BP100865)及2个不重叠但位置很近的ESTs(AV603291和AV603290)分别成簇存在(图1)。以试验动物的各组织cDNA为模板，两对引物F1和R1，F2和R2分别用来扩增这两个EST簇，分别得到844和754 bp大小的产物。为了验证这些ESTs是否属于同一个基因，设计了跨越这两个EST簇的引物，但是没有检测到任何RT-PCR产物(结果未显示)，因此推测这2个序列是两个不同的基因。用NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)中的Open Read in Frame Finder对这2个扩增产物的序列进行预测，均未发现长的开放阅读框，推测它们可能都是长的非编码RNA，此外，没有检测到不同的可变剪切体。将得到的两个长非编码RNA序列与人、小鼠和羊的EST数据库进行比对(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，未发现相似的EST序列。根据长非编码RNA命名规则将这两个基因命名为Linc24062和Linc24063，并将序列提交到GenBank(Accession No.:KU955999和KU956000)。

Dlk1～Dio3印记域包括3个父源表达蛋白编码基因Dlk1、Rtl1 和 Dio3，和几个母源表达非编码RNA Gtl2、anti-Rtl1、Meg8和 Meg9。IG-DMR是该印记域的印记调控中心。父源和母源印记基因分别用灰色和黑色表示，转录方向如箭头所示，黑点表示Dlk1-Dio3差异甲基化区域The Dlk1-Dio3 domain contains three paternally expressed protein-coding genes，Dlk1，Rtl1 and Dio3，and several maternally expressed noncoding RNA genes，Gtl2，anti-Rtl1，Meg8，and Meg9.IG-DMR is the imprinting control region in this domain.Maternally expressed genes are shown in gray and paternally expressed genes in black；the direction of their transcription is indicated.Black lollipops indicate the positions of differentially methylated region of Dlk1-Dio3 domain图1　Dlk1-Dio3印记区域Fig.1　Dlk1-Dio3 imprinted domain

2.2Linc24062和Linc24063 在不同组织的表达状态

提取3头牛各组织的RNA，用分光光度计对其进行定量并调至浓度相同。以RNA反转录后的cDNA为模板经RT-PCR扩增，并以跨内含子的引物扩增GAPGH进行对照。Linc24062和Linc24063 在被测的8个组织中分别扩增得到844和754 bp大小的片段(图 2a)，测序验证为目的产物，表明该基因在被检测组织中均表达。

2.3Linc24062和Linc24063 中SNP鉴定

用Linc24062的引物F1和R1，Linc24063的引物F2和R2分别扩增来自32头牛肝组织的DNA，分别得到844和754 bp大小的DNA片段，PCR产物回收后直接测序。在Linc24062中检测到1个c.559 C>A SNP，在Linc24063中检测到1个c.215 C>T SNP(图 2b)，鉴定的杂合子牛用于印记状态分析。

2.4Linc24062和Linc24063的印记状态分析

通过比较杂合子动物中SNP位点在DNA PCR和RT-PCR产物直接测序的峰图，来确定基因、等位基因的表达状态。测序结果显示，在检测的8个组织中，Linc24062(C等位基因)和Linc24063(T等位基因)均为单等位基因表达(图2c)，表明Linc24062 和Linc24063 在牛中是印记基因。

3　讨　论

基因组印记是指来自双亲的等位基因依赖亲本特异性而导致单等位基因表达的一种非孟德尔遗传现象[13]，第一个lncRNA是在印记区域里被鉴别出来的[14]。根据lncRNA所在的位置关系，可以将lncRNA划分为反义lncRNA，內元lncRNA，增强子lncRNA 和基因间lncRNA。除了內元lncRNA，绝大多数lncRNA在基因组印记中发挥着重要作用[15]。Dlk1-Dio3印记域作为哺乳动物基因组中最大的印记域之一，位于鼠的12号染色体末端，人14号染色体和牛的21号染色体[16-17]，该印记域内的印记基因在胚胎和胚外组织中均表达并参与胚胎及胎盘的生长发育调控，出生后主要参与神经和代谢调控[18-19]。

A. Linc24062和Linc24063在牛不同组织中的表达水平。 1～8.心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、皮下脂肪、大脑；M.DNA marker DL2000(1 000、750、500、250 bp)；RT-.阴性对照；B.牛基因组中Linc24062和Linc24063 基因SNPs的鉴定，箭头所指SNP位置。C.杂合子牛中心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、皮下脂肪、大脑8个组织的RT-PCR产物测序峰图，箭头所指SNP位置A.The expression level of Linc24062 and Linc24063 at different tissues in cattle.1-8.RT-PCR products obtained from heart，liver，spleen，lung，kidney，muscle，subcutaneous fat and brain；M.DNA marker DL2000(1 000，750，500，250 bp)；RT-.Negative control；B.Identification of SNPs in cattle Linc24062 and Linc24063 genes，the arrows point the position of SNP；C.Sequence chromatograms of RT-PCR products obtained from eight tissues of hybrid cattle，including heart，liver，spleen，lung，kidney，muscle，subcutaneous fat and brain，the arrows point the position of SNP图2　Linc24062和Linc24063的表达及印记状态分析Fig.2　Expression and imprinting status of Linc24062 and Linc24063

通过对公布的来自不同发育时期，不同组织牛EST序列进行分析，23 060个牛非编码RNA被预测到，其中绝大部分(57%)的非编码RNA是基因间转录产物[20]。目前Dlk1-Dio3印记域鉴别出来的非编码RNA均表现母系表达印记，包括Gtl2、Meg8、Meg9等[21-22]。先前本实验室获得牛Dlk1-Dio3印记域内3个长非编码RNA的不同可变剪切体，包括Gtl2的6个可变剪切体[23]，Meg8的12个可变剪切体[11]，和Meg9的3个可变剪切体[12]。本研究对Meg8与Meg9之间的表达序列进行分析，通过RT-PCR 和克隆测序的方法鉴别出两个新的非编码RNALinc24062 和Linc24063，未检测到其他的可变剪切体形式，并发现这2个LincRNAs在成年荷斯坦奶牛被检测的8个组织(心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、皮下脂肪、大脑)中均表达，表达模式与Meg8和Meg9的表达模式相似[11-12]。通过PCR产物直接测序的方法，在Linc24062 和Linc24063中分别鉴别到1个SNP(c.559 C>A 和c.215 C>T)。对杂合子牛中这两个非编码RNA的印记状态进行分析，发现Linc24062和Linc24063在被检测的所有组织中均为单等位基因特异性表达，说明Linc24062和Linc24063在牛中为印记的长非编码RNA。本研究丰富了牛Dlk1-Dio3印记域内已知的印记长非编码RNA的数量，为进一步研究该区域的调控机制及功能奠定基础。

[1]BARTOLOMEI M S，FERGUSON-SMITH A C.Mammalian genomic imprinting[J].ColdSpringHarbPerspectBiol，2011，3(7)：a002592.

[2]CARNINCI P，KASUKAWA T，KATAYAMA S，et al.The transcriptional landscape of the mammalian genome[J].Science，2005，309(5740)：1559-1563.

[3]KATAYAMA S，TOMARU Y，KASUKAWA T，et al.Antisense transcription in the mammalian genome[J].Science，2005，309(5740)：1564-1566.

[4]HUANG R，JARITZ M，GUENZL P，VLATKOVIC I，et al.An RNA-seq strategy to detect the complete coding and non-coding transcriptome including full-length imprinted macro ncRNAs[J].PLoSOne，2011，6(11)：e27288.

[5]AMARAL P P，MATTICK J S.Noncoding RNA in development[J].MammGenome，2005， 19(7-8)：454-492.

[6]HAGAN J P，O’NEILL B L，STEWART C L，et al.At least ten genes define the imprintedDlk1-Dio3 cluster on mouse chromosome 12qF1[J].PLoSOne，2009，4(2)：e4352.

[7]LIU L，LUO G Z，YANG W，et al.Activation of the imprintedDlk1-Dio3 region correlates with pluripotency levels of mouse stem cells[J].JBiolChem，2010，285(25)：19483-19490.

[8]STADTFELD M，APOSTOLOU E，AKUTSU H，et al.Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells[J].Nature，2010，465(7295)：175-181.

[9]FENG W Z，ZENG T B，ZHENG B H，et al.Imprinting and expression analysis of a non-coding RNA gene in the mouseDlk1-Dio3 domain[J].JMolHistol，2011，42(4)：333-339.

[10]HAN Z，LIU Q，HUANG Z，et al.Expression and imprinting analysis of AK044800，a transcript from theDlk1-Dio3 imprinted gene cluster during mouse embryogenesis[J].MolCell，2013，35(4)：285-290.

[11]HOU X H，LI D J，SU H，et al.Molecular cloning，expression，and imprinting status of maternally expressed gene 8 (Meg8) in dairy cattle[J].RussJGenet，2011，47(8)：994-998.

[12]ZHANG K，LI D，WANG M，et al.The differential expression of alternatively spliced transcripts and imprinting status ofMeg9 gene in cows[J].AnimGenet，2014，45(5)：660-664.

[13]VERONA R I，MANN M R，BARTOLOMEI M S.Genomic imprinting：intricacies of epigenetic regulation in clusters[J].AnnuRevCellDevBiol，2003，19：237-259.

[14]AUTUORO J M，PIRNIE S P，CARMICHAEL G G.Long noncoding RNAs in imprinting and X chromosome inactivation[J].Biomolecules，2014，4(1)：76-100.

[15]KANDURIC.Long noncoding RNAs：Lessons from genomic imprinting[J].BiochimBiophys，2016，1859(1)：102-111.

[16]SCHMIDT J V，MATTESON P G，JONES B K，et al.TheDlk1 andGtl2 genes are linked and reciprocally imprinted[J].GenesDev，2000，14(16)：1997-2002.

[17]TAKADA S，TEVENDALE M，BAKER J，et al.Delta-LikeandGtl2 are reciprocally expressed，differentially methylated linked imprinted genes on mouse chromosome 12[J].CurrBiol，2000，10(18)：1135-1138.

[18]LIN S P，YOUNGSON?N，TAKADA S，et al.Asymmetric regulation of imprinting on the maternal and paternal chromosomes at theDlk1-Gtl2 imprinted cluster on mouse chromosome 12[J].NatGenet，2003，35(1)：97-102.

[19]TAKAHASHI N，OKAMOTOA，KOBAYASHI R，et al.Deletion ofGtl2，imprinted non-coding RNA，its differentially methylated region with induces lethal parent-origin-dependent in mice[J].HumMolGenet，2009，18(10)：1879-1888.

[20]ZHIPENG Q，ADELSON D L.Bovine ncRNAs are abundant，primarily intergenetic，conserved and associated with regulatory genes[J].PLoSOne，2012，7(8)：e42638.

[21]PAULSEN M，TAKADA S，YOUNGSON N A，et al.Comparative sequence analysis of the imprintedDlk1-Gtl2 locus in three mammalian species reveals highly conserved genomic elements and refines comparison with theIgf2-H19 region[J].GenomeRes，2001，11(12)：2085-2094.

[22]DA ROCHA S T，EDWARDS C A，ITO M，et al.Genomic imprinting at the mammalianDlk1-Dio3 domain[J].TrendsGenet，2008，24(6)：306-316.

[23]SU H，LI D，HOU X，et al.Molecular structure of bovineGtl2 gene and DNA methylation status ofDlk1-Gtl2 imprinted domain in cloned bovines[J].AnimReprodSci，2011，127(1-2)：23-30.

(编辑程金华)

Two Imprinted Long Non-coding RNAs Located in CattleDlk1-Dio3 Domain

YANG Wen-zhi1，ZHANG Ming-yue1，WANG Guan-nan1，ZHAO Yu-peng2，ZHANG Wei-wei1，LI Shi-jie1*

(1.CollegeofLifeScience，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071001，China；2.HebeiNorthUniversity，Zhangjiakou075000，China)

The objective of this study was to find novel imprinted long noncoding RNAs (lncRNAs) in cattleDlk1-Dio3 domain.Transcripts mapping to this region betweenMeg8 andMeg9 were under a systematic search and 2 novel lncRNAs were identified，which were named asLinc24062 andLinc24063 according to annotated bibliography of genecode.The expression patterns ofLinc24062 andLinc24063 in adult cattle tissues were characterized using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).The results indicated thatLinc24062 andLinc24063 were expressed in all 8 tested tissues，including heart，liver，spleen，lung，kidney，subcutaneous fat，skeletal muscle and brain.The imprinting status ofLinc24062 andLinc24063 was assessed based on a polymorphism-based sequencing approach.The results showed thatLinc24062 andLinc24063 exhibited monoallelic expression in all examined cattle tissues by comparing sequence chromatograms between genomic DNA and cDNA levels at single nucleotide polymorphism (SNP) site，suggesting thatLinc24062 andLinc24063 were imprinted in cattle.

genomic imprinting；intergenic lncRNAs；Dlk1-Dio3 domain；SNP；cattle

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.013

2016-04-05

国家自然科学基金项目(31372312；30972098)；河北省自然科学基金项目(C2016204092)

杨文志(1991-)，女，河北衡水人，硕士生，主要从事动物分子遗传学研究，Tel：0312-7528270，E-mail：anshiyangwenzhi@163.com

李世杰，教授，博士生导师，Tel：0312-7528270，E-mail：lishijie20005@163.com

S823.2；S813.3

A

0366-6964(2016)09-1848-05