牦牛脾脏TF理化性质和部分生物学特性的测定

文 英，宁 鹏，李 莉，常建军

（青海大学农牧学院，青海 西宁 810016）

牦牛脾脏TF理化性质和部分生物学特性的测定

文 英，宁 鹏，李 莉，常建军

（青海大学农牧学院，青海 西宁 810016）

采用冻融—透析法提取了牦牛脾脏转移因子（transfer factor，TF），并对其澄明度、pH值等理化性质进行了测定和分析，同时对牦牛脾脏TF进行了无菌检验、热原检验、安全性试验、过敏试验、体外抑菌试验等部分生物学特性检测和分析。结果表明，用该方法提纯的牦牛脾脏TF含有DNA、核苷酸等，无菌，无热原，无毒性，无致敏性，无抗原性，符合生物制剂的质量标准。该研究对牦牛脾脏转移因子的开发利用提供了试验依据。

转移因子；理化性质；生物学特性；脾脏；牦牛

转移因子（transfer factor，TF）是从淋巴细胞中提取制得的一种多核苷酸和多肽小分子物质，它能转移多种抗原的细胞免疫，包括真菌、细菌、病毒、寄生虫、组织相容性抗原和肿瘤抗原的细胞免疫，是一种新型免疫增强制剂［1］。实践证明，该制剂对人体安全无毒，无药残，口服或注射同样有免疫活性。近年来，我国已陆续开展了对畜禽TF的研究和应用，先后试制了猪、羊、马、兔、牛以及犬的非特异性TF和特异性TF［2］，在畜禽疾病的防治上已取得了可喜的成绩，但对其他动物来源的转移因子研究很少。生活在青藏高原上的牛、羊，由于本地区自然生态因素的不断作用和影响，形成了许多适应特殊生态环境的生态学特征和生理特点，如耐寒怕热、喜干燥怕潮湿、耐低压和耐缺氧等，因而对其生活环境形成了很强的免疫能力。该试验依托青藏高原特有的牦牛物种为材料，提取具有激活机体细胞免疫功能效应的转移因子，并对其理化性质及部分生物学活性进行了测定，以期为牦牛转移因子的开发应用提供一定的试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料：牦牛脾脏，取材于青海省乐家湾屠宰场，-40℃冰箱保存。

1.1.2 实验动物：昆明系小白鼠16只、体重18～22 g，由青海省实验动物中心提供。兔6只、豚鼠6只，购于青海省城北兴惠养殖场。

1.1.3 主要仪器设备：FSH-2A可调高速匀浆机（常州市华普达教学仪器有限公司）、TD24-WS低速台式离心机、TDZ5-WS湘仪离心机、电热手提式压力蒸汽灭菌器（上海医用核子仪器厂）、LRH系列生化培养箱（上海一恒科技有限公司）等。

1.1.4 菌株：金黄色葡萄球菌（P25）、大肠埃希菌（W18）、沙门菌（81050），由青海大学农牧学院动物医学系预防实验室提供。

1.1.5 培养基：营养肉汤、营养琼脂、MH（A）培养基、肝块肉汤培养基、血液琼脂平板，均按常规方法制作。

1.1.6 滤纸片的制：用打孔器将滤纸制成直径为6 mm的圆形纸片，装于洁净的培养皿内，高压灭菌后在温箱中烘干。将无菌圆形滤纸片浸泡于制备的转移因子中2 h，制成提取液滤纸片备用。

1.2 方法

1.2.1 转移因子的制备：将冻存的牦牛脾脏取出融化，去脂肪、被膜，充分洗净。用组织捣碎机绞碎，加适量生理盐水后，用高速组织捣碎机高速（12 000 r/min）匀浆2次，每次1 min。将匀浆置-20℃反复冻融3次。最后一次融化后以3 000 r/min离心30 min，取上清液，将上清液置透析袋内，用无热原的冷生理盐水在0～4℃环境下透析过夜，收集袋外透析液（即为制备的转移因子）于-20℃保存备用［3-4］。

1.2.2 澄明度：肉眼直接观察牦牛脾脏TF提取物的澄明度，辨识其气味。

1.2.3 pH值：用精密pH试纸测定。

1.2.4 蛋白质反应：取少量透析外液用25%磺基水杨酸检测，观察有无白色浑浊物出现。

1.2.5 提取液生物学活性检测：无菌检验、热原检验、安全性试验及过敏试验均按《中国生物制品规程 2000 版暂行规程》［5］要求进行。

1.2.5.1 无菌检验：将提取液接种于普通肉汤、血液琼脂斜面、普通琼脂斜面、肝块肉汤培养基，37℃培养7 d，观察有无细菌等微生物生长。

1.2.5.2 热原检验：兔子6只，随机分为2组，测其体温正常后15 min内耳静脉缓缓注入温热至约38 ℃的 TF 样品，剂量为 3 mL/（kg·BW），然后，每隔1 h测1次体温，共测3次，观察并判断结果。

1.2.5.3 安全性试验：取小鼠16只，随机等分为4组。第1组腹腔注射待检TF液0.5 mL/只；第2组腹腔注射待检TF液1.0 mL/只；第3组腹腔注射待检TF液2.0 mL/只；第4组注射生理盐水2.0 mL/只作对照。观察7 d，全部剖杀，检查各组织脏器情况。

1.2.5.4 过敏试验：取豚鼠6只，隔日腹腔注射供试品0.5 mL/只，连续3次；然后将其中4只豚鼠随机分成2小组作为试验组，每组2只，分别于第1次注射后14 d及21 d静脉注射供试品0.5 mL/只，注射后15 min内观察并判断结果。剩余2只作对照。

1.2.5.5 体外抑菌试验：按刘湘新等［6］介绍的方法进行操作，按一般制备培养基方法无菌培养金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌。挑取3株菌株的MH纯培养物，分别用灭菌的生理盐水洗下稀释并与麦氏比浊管进行比浊，选取5×107～5×108个/mL浓度，15 min内用无菌棉拭子蘸取已校正的菌液，涂布在4 mm厚MH（A）平板表面，每块平板涂布3次，每次旋转60°，均匀接种，干燥平板3～5 min后。每个培养皿按梅花形放5个位点，每个位点中放入浸有TF注射液的圆形滤纸片，37℃培养24 h，观察抑菌效果。结果判定：抑菌直径＞15 mm为高敏（S），抑菌直径 10～15 mm 为中敏（I），抑菌直径＜10 mm为低敏（L），无抑菌圈为不敏感（R）［7］。

1.2.5.6 牦牛脾脏转移因子活性分析：采用白细胞黏附抑制试验测定牦牛脾脏转移因子活性。

2 结果

2.1 澄明度 牦牛脾脏TF提取物为透明、淡黄色、微腥味的液体。

2.2 pH值 经检测牦牛脾脏TF提取物的pH值在7.0左右，符合制剂要求。

2.3 蛋白质反应 蛋白质反应未出现混浊或沉淀，说明牦牛脾TF中不含大分子蛋白质。

2.4 无菌检验 将提取液接种于普通肉汤、血液琼脂斜面、普通琼脂斜面、肝块肉汤培养基，37℃培养7 d后，观察均无细菌生长。

2.5 热原检验 经注射牦牛脾脏TF提取液的兔体温没有升高现象，热原试验结果为阴性。

2.6 安全性试验 注射牦牛脾脏提取液小鼠与对照组小鼠一样，精神、食欲、毛色及活动状况均正常，无一例死亡。剖检后内部脏器无异常变化，表明安全性试验结果为阴性。

2.7 过敏试验 6只豚鼠第14天及第21天静脉注射供试品后15 min内未见连续干咳、呼吸困难、虚脱等明显病理症状及死亡等现象，注射部位也未见异常现象，说明过敏试验结果为阴性。

2.8 体外抑菌试验结果 体外抑菌试验结果表明，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌对牦牛脾脏TF均呈中度敏感（见表1）。

表1 牦牛脾脏转移因子体外抑菌试验结果

2.9 牦牛脾脏转移因子活性分析 牦牛脾脏TF提取物黏附白细胞抑制指数（NAI）为31%，NAI≥20%，判定为活性合格。

3 结论与讨论

试验采用的透析方法［6］简便、低廉、易于操作，不需要特殊的设备和器材，制得的牦牛脾脏转移因子为成分复杂的混合物，含有DNA、核苷酸等，具有和其他动物脾TF相似的理化性质，无菌，无毒性，无热原，无致敏性，无抗原性，符合兽医临床用药标准。该结果为进一步开发利用牦牛脾脏转移因子提供了试验依据。

体外抑菌试验结果表明，牦牛脾脏TF对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌有一定的抑制作用，呈中度敏感，与乔宏兴等［8］抑菌试验结果比较，该试验结果敏感程度不高，这与所用判定标准不同有一定关系。而牦牛转移因子对细菌病的预防和临床治疗效果则有待进一步研究。

［1］朱其太.转移因子及其在动物疾病防治中的应用［J］.中国兽医科技，1992，22（1）：4-6.

［2］刘润珍，李世雄，姜力，等.毛皮动物用转移因子的研究与应用［J］.黑龙江畜牧兽医，1996（8）：4-6.

［3］孔庆波，陈进军，常建军，等.猪犬脾TF的提取及理化性质和部分生物学特性测定 ［J］.中国兽药杂志，2007，41（5）：5-9.

［4］孔庆波，陈进军，常建军，等.猪转移因子对犬中性粒细胞数量和活性的影响［J］.中国畜牧兽医，2008，35（1）：47-51.

［5］中国生物制品标准化委员会.中国生物制品规程2000版暂行规程［M］.北京：化学工业出版社，2000.

［6］刘湘新，刘进辉，何湘蓉，等.转移因子的制备与生物活性研究［J］.中兽医医药杂志，2005（6）：33-35.

［7］CONWAY P L.Development of intestinal microbiota［M］//MACKIE R I，WHITE B A，ISAACSON R E.Gastrointestinal Microbiology.Volume 2：Gastrointestinal Microbes and Host Interactions.New York：Chapman&Hall，1996：3-38.

［8］乔宏兴，白静.猪脾转移因子的制备及临床应用［J］.中国畜牧兽医，2011，38（7）：203-205.

Physical and Chemical Properties of Transfer Factor（TF） in Yak Spleen and Determination of Its Selected Biological Characteristics

WEN Ying，NING Peng，LI Li，CHANG Jian-jun
（College of Agricultural and Animal Husbandry，Qinghai University，Xining 810016，China）

In this study，the transfer factor （TF） in yak spleen was extracted by using freezing-thawing-dialysis method.The physical and chemical properties of the extracts,such as clarity and pH values,were determined and analyzed.The sterility test,pyrogen test,safety test,allergy test and in vitro antibacterial test were carried out to biologically characterize the extracted TF.The results revealed that the TF extracted by the method contained DNA and nucleotide acid,and it was germ free,non-pyrogen,non-toxic,non-allergic,non-antigenic.All of the tested indicators of the extracted TF complied with the quality standard of biological preparation.The results of the study provide experimental basis for the development and application of TF in yak spleen.

transfer factor；physical and chemical properties；biological characteristics；spleen；yak

S859.79；S852.4

A文章顺序编号：1672-5190（2016）05-0001-02

2016-05-12

项目来源：青海省国际科技合作计划项目（2014-HZ-801）。

文英（1974—），女，副教授，硕士，主要研究方向为预防兽医学。

常建军（1969—），男，教授，硕士，主要研究方向为动物性食品卫生检验和安全性。

（责任编辑：钱英红）