左旋延胡索乙素对吗啡条件性位置偏爱大鼠伏核NR1蛋白表达的影响*

邱成楷，余守洋，蒋奇阳，姚东劼，叶维坤，涂　平，白威峰，罗素元

(遵义医学院 细胞生物学教研室，贵州 遵义　563099)



基础医学研究

左旋延胡索乙素对吗啡条件性位置偏爱大鼠伏核NR1蛋白表达的影响*

邱成楷，余守洋，蒋奇阳，姚东劼，叶维坤，涂平，白威峰，罗素元

(遵义医学院 细胞生物学教研室，贵州 遵义563099)

目的 研究左旋延胡索乙素(l-tetrahydropalmatine，l-THP)对吗啡诱发条件性位置偏爱 (conditioned place preference, CPP)大鼠伏核(nucleus accumbens，NAc)中N-甲基-D-天冬氨酸受体NR1亚基(NR1)表达改变的影响。方法 大鼠随机分组，即正常对照组、模型CPP组、生理盐水治疗组及l-THP低(0.94 mg/kg)、中(1.88 mg/kg)和高(3.76 mg/kg)治疗组。正常对照组皮下注射等量生理盐水外，剩余各组大鼠采用颈背部皮下剂量递增法注射吗啡(起始剂量10 mg/kg，每天递增10 mg/kg，至注射10 d时为100 mg/kg)，经 CPP训练10 d，末次训练后48 h进行 CPP检测确认CPP模型成功。各治疗组大鼠灌胃给药，每天1次，连续治疗6 d后进行CPP检测，之后处死大鼠并采用脑立体定位仪取大鼠NAc脑组织，利用Western Blot方法检测NR1基因的蛋白表达。结果 经CCP检测，模型组大鼠在白箱(吗啡伴药箱)停留时间，与生理盐水组比较明显延长(P<0.05)，而经l-THP 1.88和3.76 mg/kg 治疗后，停留时间恢复至正常对照组水平。Western Blot检测到CPP大鼠NAc核团NR1的蛋白表达较正常对照组显著增加(P<0.01)，l-THP 1.88和3.76 mg/kg治疗后，NR1蛋白表达被逆转。结论 在大鼠吗啡精神依赖过程中l-THP可显著抑制NAc核团中NR1蛋白表达的增加，这一作用可能是l-THP加速大鼠吗啡CPP效应消退的机制之一。

左旋延胡索乙素；条件性位置偏爱；吗啡；精神依赖；NR1；大鼠

在戒毒领域，消除毒品导致的精神依赖以降低复吸率是治疗戒毒的核心问题，阿片类物质成瘾导致的精神依赖则是复吸的一个重要因素，故寻找对其有效治疗的药物非常紧迫。在阿片类物质成瘾过程中，阿片类精神依赖的形成和维持主要是大脑神经奖赏环路引起的奖赏效应[1]。本课题组前期实验曾发现，NR1亚基在吗啡精神依赖大鼠伏核(NAc)(系脑奖赏环路的核团之一)中表达量增加[2]，提示精神依赖可能与吗啡引起NR1亚基的表达变化有关。另外，之前的实验还发现[3]，左旋延胡索乙素(l-THP)可以衰减大鼠条件性位置偏爱(CPP)效应，且可逆转大鼠奖赏环路多个核团中N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体NR2B亚基的上调，并认为这可能是l-THP发挥戒毒作用的药理学机制之一[4-5]。那么，l-THP是否也可以逆转NR1的异常表达则有待于进一步研究。本实验通过观察l-THP对大鼠吗啡CPP效应的消退作用以及对NAc核团中NR1蛋白表达水平的影响，探讨l-THP取消CPP效应与NR1蛋白表达之间的关系，为l-THP治疗阿片类精神依赖提供实验依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物8周龄健康雄性SD大鼠，购于第三军医大学实验动物中心(许可证号：SCXK渝2012-0005)，实验前将大鼠放置动物房适应性饲养1周。动物房通风良好，恒温24 ℃，光照周期8∶00-20∶00，大鼠自由进食饮水。

1.1.2试剂与药品盐酸吗啡注射液，批号：TD2006-0028，购自沈阳第一制药厂；l-THP由广西中医药研究所提供；兔NR1受体一抗购自美国BD公司；山羊抗兔二抗购自北京博奥森公司。

1.1.3实验仪器条件性位置偏爱(CPP)实验箱参照文献[6]制作，箱体长、高和宽分别为600、300和300 mm，制成大小相同的黑白2个箱子，黑箱底部粗糙、白箱底部光滑。黑白箱之间有1个可以限制大鼠自由穿梭的隔板(高250 mm)，抽取隔板大鼠可以在黑白箱之间自由穿梭，CPP实验视频跟踪计算机自动分析系统由上海吉量软件科技有限公司提供。

1.2实验方法

1.2.1建立吗啡CPP模型、分组及给药大鼠分批放置于CPP条件箱(黑白箱)中任其自由穿梭，连续3 d，1次/d，15 min/次，第3 天记录大鼠在黑、白箱中停留的时间，剔除对黑箱或白箱有明显偏爱的大鼠，再根据大鼠喜黑厌白的天然特性，确定黑箱为天然偏爱箱，白箱作为吗啡伴药箱。最后将筛选合格的60只大鼠随机分为6组(每组10只)；即正常对照组(NS组，皮下注射生理盐水)、吗啡模型组(CPP)、生理盐水治疗组、l-THP高剂量(3.76 mg/kg)、中剂量(1.88 mg/kg)和低剂量(0.94 mg/kg)治疗组。

模型建立：吗啡模型组每天上午剂量递增法颈部皮下注射吗啡，第1天为10 mg/kg，逐日递增10 mg/kg，至第10 天为100 mg/kg，每天注射吗啡后20 min将大鼠置白箱进行CPP训练40 min；下午注射生理盐水后按上述方法将大鼠放置黑箱训练，持续10 d。各组大鼠在末次训练48 h后经CPP检测，在白箱子中停留时间显著延长，确认大鼠CPP模型成功。

模型大鼠每天灌胃给药1次，连续治疗6 d，经CPP测试后戊巴比妥钠麻醉处死大鼠。各组处死大鼠，参照脑立体定位图谱取其NAc核团[7]，采用Western Blot技术检测其NR1蛋白的表达。

1.2.2Western Blot检测NR1受体将所收集的大鼠伏核组织进行称重，置4 ℃预冷裂解缓冲液中匀浆，离心(12 000 rpm/min)后转移取上清至离心管中。根据BCA蛋白试剂盒说明检测NR1蛋白浓度。经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE) 电泳分离蛋白，100 V电泳约2 h，100 mA转膜1.5 h，5%脱脂奶封闭1 h后，兔抗NR1一抗(1∶2 000) 孵育4 ℃过夜。次日，复温1 h后TBST 洗3次，每次10 min；山羊抗兔二抗(1∶1 500)孵育1 h后，再次TBST洗3次，每次10 min。化学发光试剂Pico Chemiluminescent Substrate A、B液各1 mL, 混匀，均匀滴加于PVDF膜上，闭光孵育3 min，将膜放置于一干净透明的塑料薄膜中，用柯达胶片曝光。曝光后的胶片用扫描仪扫描后，以β-actin为内参，利用Image-J软件对实验组和对照组的蛋白条带进行灰度值计算。

2　结果

2.1CPP效应检测结果经CPP检测正常对照组大鼠训练前后在白箱停留时间无显著差异，而CPP模型组大鼠训练后较训练前在白箱停留时间明显增加(P<0.01)。经l-THP治疗6 d后，与生理盐水治疗组比较，延胡索乙素1.88和3.76 mg/kg组大鼠在白箱的停留时间明显缩短(P<0.01，见表1和图1)。

组别大鼠在白箱停留时间(s)训练前训练后治疗6d后正常对照组383±62401±76 —模型组407±83528±40ab—生理盐水治疗组386±75527±55ab524±79延胡索乙素低剂量组396±81523±32ab519±47延胡索乙素中剂量组389±95528±42ab386±76c延胡索乙素高剂量组399±65536±67ab386±88c

a：训练前后各组比较，P<0.01；b：与正常对照组比较，P<0.01；c：与生理盐水治疗组比较，P<0.01。

图1　各组大鼠训练前后在白箱中停留时间

2.2各组大鼠NAc脑区中NR1 蛋白的表达与正常对照组比较，吗啡模型组大鼠NAc核团中NR1蛋白表达显著增加(P<0.01)，与NS治疗组比较，l-THP 1.88和3.76 mg/kg组大鼠治疗6 d，NAc脑区NR1蛋白表达水平显著降低(P<0.01)(见图2A、B)。

1.正常对照组；2.模型组；3.生理盐水治疗组；4.延胡索乙素低剂量组；5.延胡索乙素中剂量组；6.延胡索乙素高剂量组。a：与正常对照组比较，P<0.01；b：与生理盐水治疗组比较，P<0.01。图2　各组大鼠训练前后及治疗后NAc脑区NR1蛋白的表达

3　讨论

在药物成瘾研究中，CPP实验动物模型[8-10]主要是用来判别药物奖赏效应和精神依赖性。本实验结果发现，吗啡戒断后CPP模型组大鼠在白箱停留时间明显增加，说明大鼠对吗啡产生了精神依赖。与生理盐水治疗组比较，l-THP 1.88和3.76 mg/kg治疗6 d，大鼠在白箱停留时间显著缩短，表明l-THP的治疗可促进吗啡CPP效应的消退，即l-THP对吗啡精神依赖具有治疗作用[5]。模型大鼠NR1的蛋白表达在NAc脑区显著增加，经l-THP 1.88和3.76 mg/kg治疗后，大鼠NR1的表达量显著降低，提示NAc脑区中NR1表达的上调可能参与了吗啡精神依赖的形成。经过l-THP治疗后，NR1的表达恢复到正常水平，表明l-THP通过抑制NAc脑区中NR1的表达是其加速衰减CPP效应的又一药理作用机制。

以往研究证实NMDA受体参与神经系统奖赏效应及突触可塑性，而且还认为NMDA受体的NR2B是介导调控阿片类药物精神依赖的一个重要亚基，吗啡药物成瘾模型中，奖赏环路和学习与记忆相关脑区中的NR2B的表达都会发生改变[11]。本课题组及其他团队近期研究发现[2]，NMDA受体的NR1亚基在精神依赖条件下的NAc核团中表达显著增加，表明NR1在阿片类药物精神依赖的形成和维持过程中也具有重要作用，因而NR1也可成为治疗阿片类药物成瘾的潜在靶点。NR1做为NMDA的必需功能亚基，可能在NR2B的协同作用下介导阿片类精神依赖，其通过细胞内Ca2+浓度增加，促进DA释放增加、脑内多巴胺奖赏系统活性增强，进而对阿片类药物精神依赖的形成和维持起着重要的作用。l-THP是一种植物源性钙拮抗剂[12-14]，可通过调节细胞内钙离子浓度，促进吗啡CPP效应的消退[15]。除此之外，l-THP是否还有其它作用机制尚需进一步研究加以证实。

[1] Russo S J, Dietz D M, Dumitriu D, et al. The addicted Synapse: mechanisms of synaptic and structural plasticity in nucleus accumbens[J]. Trends in Neurosciences, 2010, 33(6): 267-276.

[2] 余守洋, 蒋奇阳, 涂平, 等. 吗啡精神依赖大鼠VTA-NAc-PFC神经环路NR1表达变化[J].神经解剖学杂志, 2014, 30(6): 697-700.

[3] 杨明理, 郭萍, 钱刚, 等. 延胡索和左旋延胡索乙素的条件性位置偏爱效应[J]. 中国药物依赖依赖性杂志, 2010, 19(4): 259-261.

[4] 郭萍, 钱刚, 凌锌, 等. 吗啡精神依赖VTA-NAc-PFC神经环路谷氨酸递质和NR2B表达变化[J]. 中华神经医学杂志, 2011, 10(5): 471.

[5] 罗素元, 郭萍, 钱刚, 等. 延胡索水提物及左旋延胡索乙素抗吗啡条件性位置偏爱效应机制研究和效果比较[J]. 中国中药杂志, 2012, 37(22): 3457-3461.

[6] Randall C K, Kraemer P J, Bardo M T. Morphine-induced conditioned place preference in preweanling and adult rats[J]. Pharmacol Biochem Behav, 1998, 60(1): 217-222.

[7] 包新民, 舒斯云. 大鼠脑立体定位图谱[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1991: 9-60.

[8] Einstein E B, Asaka Y, Yeckel M F, et a1. Postsynaptic potentials and morphine conditioned place preference require both galanin receptor 1 and galanin receptor 2[J].Eur J Neurosci, 2013, 37(9): 1541-1549.

[9] Otis J M, Fitzgerald M K, Mueller D. Infralimbic BDNF/TrkB enhancement of GluN2B currents facilitates extinction of a cocaine-conditioned place preference[J]. J Neurosci, 2014, 34(17): 6057-6064.

[10] Zhong H J, Huo Z H, Dang J, et al. Functional polymorphisms of the glutamate receptor N-methy D-aspartate 2A gene are associated with herion addiction[J]. Genet Mol Res, 2014, 13(4): 8714-8721.

[11] Portugal G S, Ream A H, Fakiraet A K, et al. Hippocampal long-term potentiation is disrupted during expression and extinction but is restored after reinstatement of morphine place preference[J]. J Neurosci, 2014, 34(34): 527-538.

[12] 任付先, 金爱萍, 牛小麟, 等. 植物性钙拮抗剂延胡索乙素的药理作用及临床作用[J]. 世界最新医学信息文摘, 2003, 3(2): 672-674.

[13] 周亚光, 苏明华, 杨光田, 等. 左旋四氢巴马汀对大鼠海马神经元钙超载损伤的保护作用[J]. 中西医结合心脑血管病杂志, 2010, 8(1): 81-82.

[14] 孟红旭, 王宝, 刘建勋, 等. 丹酚酸B和延胡索乙素对大鼠心室肌细胞L-钙型通道的影响[J]. 中国中西医结合杂志, 2011, 31(11):1514-1517.

[15] 王燕波, 任燕华, 郑继旺, 等. 左旋四氢巴马汀对吗啡条件性位置偏爱的影响[J]. 中国药物杂志, 2005, 21(12): 1442.

[收稿2016-05-10;修回2016-06-28]

(编辑：王静)

The effect ofl-tetrahydropalmatine on NR1 protein expression of NAc in morphine-induced Conditioned Place Preference rats

QiuChengkai,YuShouyang,JiangQiyang,YaoDongjie,YeWeikun,TuPing,BaiWeifeng,LuoSuyuan

(Department of Cell Biology, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To observe the change on expression of the N-methyl-D-aspartate receptor NR1 subunit (NR1) in nucleus accumbens (NAc) of the morphine induced Conditioned Place Preference (CPP) rat after the treatment withl-tetrahydropalmatine (l-THP). Methods Sixty rats were randomly divided into normal NS group,morphine induced Conditionned Place Preference (CPP) model group, normal NS treatment group and three dosages ofl-THP treatment groups. The rats were trained in black compartments and white ones (drug-paired compartment) with the increasing doses of morphine for 10 days (hypodermically injected from 10 to 100 mg/kg). Models of CPP were validated in those psychological dependence rats after 48 h training. The high, medium and low dosage group ofl-THP were givenl-THP 0.76, 1.88 and 0.94 mg/kg lavage treatment, respectively. NS treatment group were lavaged normal saline for 6 days and they were killed after test of CPP. Western blotting detected the expression changes of NR1 protein.Results Compared with NS control group, the residence time in the white box (morphine pair box) of CPP model group rats was significantly longer (P<0.01). After the treatment ofl-THP (3.76, 1.88 and 0.94 mg/kg), residence time return to that of normal saline control group. Compared with the NS control group, the expression levels of NR1 was increased in NAc in CPP group, but NR1 ofl-THP (3.76 and 1.88 mg/kg) reduced in NAc (P< 0.01). Conclusion Thel-THP could reverse the NR1 protein expression in NAc of the morphine psychological dependence rats, might be the potential mechanism of pharmacological effects which should accelerate the fading process of morphine CPP effects in the experimented bodies.

l-tetrahydropalmatine (l-THP); CPP; morphine; psychological dependence; NR1; rat

贵州省科技厅社会攻关项目(NO：黔科合SY字[2013]3065)；遵义医学院博士启动基金资助项目(NO：F586)；贵州省2013年度联合基金计划项目(NO：黔科合J字LKZ[2013]22)。

罗素元，女，教授，硕士生导师，研究方向：药物成瘾的神经生物学机制，E-mail:swx_100@163.com。

R966

A

1000-2715(2016)04-0358-04