人脐带血内皮祖细胞的分离、培养与鉴定

赵梦蝶，查从亮，江　浩，项　平



·基础医学·

人脐带血内皮祖细胞的分离、培养与鉴定

赵梦蝶1，查从亮1，江浩1，项平2

目的：分离、培养、鉴定人脐带血内皮祖细胞(EPCs)，为获取大量血管内皮祖细胞提供方法。方法：脐带血采集后，采用6%羟乙基淀粉沉降法和密度梯度离心法获取脐带血单核细胞，再将单核细胞接种于铺设有纤维连接蛋白的培养瓶中，经过体外诱导、培养、分化，完成传代扩增；通过免疫组织化学、免疫荧光染色、流式细胞术对细胞进行鉴定。结果：细胞培养第5天呈现集落样生长，单个细胞呈圆形或梭形，2周后细胞长满瓶底,呈鹅卵石样外观。免疫组织化学检测显示，CD31兔抗人单克隆抗体阳性率91.5%，Anti-Von Willebrand factor antibody(vWF)相关抗原兔抗人单克隆抗体的阳性表达率为72.4%；细胞免疫荧光染色检测显示，吞噬Dil标记的乙酰低密度脂蛋白(+)，发出红色荧光；结合FITC标记的荆豆凝集素Ⅰ (+)，发出绿色荧光；双染(+)，呈黄色荧光。流式细胞术检测CD34阳性率93%，血管内皮细胞生长因子受体2阳性率88.5%，CD133阳性率84.8%。结论：从脐带血中可获取大量CD34+、VEGFR-2+及CD133+血管内皮祖细胞。

干细胞;内皮祖细胞;人脐带血

早在1997年，ASAHARA等[1]首次从人外周血中分离出一种表达内皮细胞特异性抗原的单核细胞，其血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2)及CD34都显示为阳性，显微镜下呈梭形生长，而且其结构成管腔样，将其定名为内皮祖细胞(EPCs)。EPCs作为血管内皮细胞的前体细胞，具有游走性，并可逐步定向增殖分化为成熟的血管内皮细胞[2]，在缺血组织的血管新生、损伤的血管再内皮化、作为再生医学工具及作为肿瘤治疗的靶点等方面发挥重要作用。但EPCs的定义、鉴别及特征仍存在争议[3-10]。本实验应用6%羟乙基沉淀法从脐带血中分离培养EPCs并鉴别，现作报道。

1　材料与方法

1.1材料实验细胞：经我校医学伦理委员会认证通过，并经患儿家属悉知实验目的后同意，取我院足月健康剖宫产新生儿脐带血。主要试剂与仪器:淋巴细胞分离液(天津TBD公司);胎牛血清(杭州四季青公司);胰酶消化液(江苏碧云天公司);EGM-2 培养基(Lonza,美国);人纤维连接蛋白(美国 Sigma公司);2%多聚甲醛(美国Sigma公司);肝素(上海伯奥生物科技有限公司) ；6%羟乙基淀粉(天津TBD公司);Dil标记的乙酰低密度脂蛋白(美国MolecularProbe公司) ;FITC标记的荆豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)(美国Sigma公司);anti-humanCD133/PE(eBioscience,美国);anti-humanCD34-FITC(eBioscience,美国);antiKDR/APC(eBioscience,美国)。

1.2方法

1.2.1人脐带血的征求采集及内皮祖细胞的提取[11-12]首先,配置抗凝血用肝素(用0.9%氯化钠注射液将其稀释为浓度50 U/mL)4 mL注入无菌采血瓶中，无菌条件下抽取剥离胎盘的脐静脉血60～80 mL于该瓶，摇晃使二者混匀抗凝后，当即置于4 ℃冰盒中转运至细胞培养室。脐带血中加入6%羟乙基淀粉(6%羟乙基淀粉∶脐血=1∶4)，于23 ℃静置40 min后，出现富含白细胞的上层血浆，收集8 mL上层清液，并用蓝色枪头贴管壁缓慢加入于15 mL离心管内(离心管事先加入4 mL淋巴细胞分离液)，2 000 r/min去闸离心20 min，离心后可见液体分为4层，吸取呈白色絮状物的第二层白膜层,即为所要的单核细胞层。

1.2.2细胞的培养提前1 d用人纤维连接蛋白包被6孔板，将所取的单核细胞加入6孔板，约接种5×105个单个核细胞，在每孔加入EGM-2 培养基2 mL，并放置于37 ℃、5%CO2、湿度≥95%的细胞培养箱中培养。24 h后观察贴壁细胞生长状况，半量换液。此后每隔1 d观察1次，并进行全量换液。10 d后细胞长满6孔板，按1∶2完成传代。

1.2.3绘制生长增殖曲线取生长增殖良好呈铺路石状密度排列的EPCs，用胰酶消化，在新鲜培养基中吹打成细胞悬液后计数。根据细胞计数结果按6孔板每个小孔5×104/mL作传代培养接种细胞，共接种细胞36孔。首次计数于24 h后，其余各次每隔24 h 1次，每次取3孔细胞，分别计数。计算平均值。连续计数12 d。根据细胞计数所得具体结果，绘制生长发展曲线。

1.2.4细胞免疫化学染色法在单个核细胞制成细胞爬片后，使用Anti-Von Willebrand factor antibody(vWF)相关抗原兔抗人单克隆抗体和CD31兔抗人单克隆抗体进行免疫化学染色，经梯度乙醇脱水和中性树胶封固后，光学显微镜下观察贴壁细胞vWF和CD31阳性率。

1.2.5双荧光染色鉴定取培养13～14 d的EPCs,用PBS清洗2次,将配置好含Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL) 10 μg/mL的EGM-2培养液加入培养板中,置于37 ℃的培养箱15 min孵育细胞,再用PBS清洗3次,每次3 min,常温下用4%多聚甲醛固定10 min,PBS清洗3次,每次3 min。再将配置好含FITC-UEA-Ⅰ 10 μg/mL的PBS液加入培养板中，置于37 ℃的培养箱15 min孵育细胞,再用PBS清洗3次,在激光共聚焦显微镜观察。选取4个随机视野,观察荧光表达，阳性细胞为双荧光均表达,取阳性细胞计数的平均数。

1.2.6流式细胞术取培养10 d的新分离的人脐带血单个核细胞，分别加入FITC标记的抗大鼠CD133，PE标记的抗大鼠CD34各2 μL，送流式中心流式细胞仪上机检测。

2　结果

2.1EPCs形态学观察细胞呈梭形生长(见图1)。

2.2EPCs生长曲线记数法测定细胞生长曲线结果显示，第1～4天为细胞生长潜伏期，对数生长期一般为培养第5～9天，生长平台期一般为培养后第10～12天，表明体外培养的人脐血内皮祖细胞增殖迅速，生物学性能稳定(见图2)。

2.3细胞免疫化学染色法结果细胞呈棕褐色呈阳性表达，CD31在EPCs的阳性表达率(88.95±6.23)%，vWF为(74.01±8.42)%(见图3)。

2.4双荧光染色鉴定结果已分化的EPCs可吞噬FITC-UEA-Ⅰ和DiI-acLDL，并在激光共聚焦显微镜下呈现不同荧光。当其吞噬了FITC-UEA-Ⅰ后，可见绿色荧光；当其吞噬了DiI-acLDL后，可见红色荧光。正在分化的EPCs既可吞噬FITC-UEA-Ⅰ，又可吞噬DiI-acLDL，则在激光共聚焦显微镜下呈黄色荧光(见图4) 。

2.5流式细胞术鉴定结果新分离的人脐带血单个核细胞中，CD34+细胞占2.5%，CD133+细胞占4.2%， CD34+/CD133+细胞占2.1%(见图5)。

3　讨论

由于EPCs在血管新生中具有重要地位[13]，近年来快速成为血管研究热点。目前，EPCs的主要来源为脐带血和骨髓。脐带血取材方便，来源丰富，富含EPCs，可分离纯化出大量EPCs并使其能在体外环境下稳定生长，旺盛增殖以满足各类实验需要。

本实验体外培养扩增的人脐血单个核细胞，相继出现贴壁、变形、形成集落、形成梭形细胞、形成线状结构、形成铺路石样排列，符合ASAHARA等[1]的研究报道。细胞生长发展曲线绘制，在培养第1～4天细胞增殖缓慢，为相对抑制期，第5～10天细胞快速增殖，逐渐到达平台期。

确切描述EPCs及其前体存在一定困难，因为现在并不知道这类细胞的大多数分子和表型决定簇。实际上，造血细胞、成熟内皮细胞、内皮祖细胞的表面蛋白之间存在非常大的重叠[14]。尤其是来源于血管壁的成熟的内皮细胞以及有成血管细胞潜能的内皮祖细胞，二者的内皮特异性标志物可能表达相似，分别是血管内皮钙黏蛋白、酪氨酸激酶受体1、酪氨酸激酶受体2、CD34和血管内皮生长因子受体2[15-16]。

现有一系列不同的方法用于测定早期及晚期EPCs集落，其标志物包含CD34+、CD133+、血管内皮生长因子受体2+、CD34+/血管内皮生长因子受体2+，CD34+/CD117+/血管内皮生长因子受体2+、CD34+/CD133+/血管内皮生长因子受体2+等[17]。因此，有一些矛盾存在于内皮祖细胞的研究中。目前，内皮祖细胞表面标志物中，较为公认的为血管内皮生长因子受体2、CD34[18]及CD133[19]。有研究认为CD133、CD34二者同时阳性更重要[20]。也有的研究认为CD133比CD34更有意义，原因在于CD133不表达成熟内皮细胞，其在分化过程中下调迅速。因此,CD133可用于排除成熟内皮细胞的标志[21]。然而，有学者[22]从CD34-的单核细胞中，也能通过诱导培养也能获得内皮祖细胞，因此内皮祖细胞的表面标志物具有不确定性。近年，一种特殊类型的T细胞被HUR等[23]首次报道，称其组成了EPs集落的中心，该T细胞趋化因子受体4+、CD3+、CD31+。

研究[24]表明，EPCs是由Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白/凝集素双阳性细胞定义的，可采用其双阳性来鉴定细胞。在细胞培养扩增的第7天，使用此方法鉴定，证实所培养的细胞大多数为EPCs。

综上所述，本实验成功从人脐血中分离出EPCs并在体外进行培养扩增，培养过程中分别测定其表面标记鉴定。因此，体外培养及鉴定EPCs可为将来治疗缺血性疾病的研究提供方法，体外扩增EPCs可为将来提供移植细胞的来源。EPCs满足组织工程的需求，是种子细胞的理想细胞之一[25]。

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(本文编辑刘梦楠)

Study on the separation,culturation and identification of human umbilical cord blood progenitor cells

ZHAO Meng-die1,ZHA Cong-liang1,JIANG Hao1，XIANG Ping2

(1.DepartmentofRadiotherapy,2.CentralLaboratory,TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233004,China)

Objective:To study on the separation,culturation and identification of human umbilical cord blood progenitor cells from human cord blood progenitor cells (EPCs),and provide a method to obtain a large number of endothelial progenitor cells.Methods:After cord blood were collected,with methods of 6% hydroxyethyl starch sedimentation and density gradient centrifugation,we obtained cord blood mononuclear cells.And then the cells were seeded in culture flasks laid fibronectin.After the cells were induction culturation,and differentiationinvitro,passage and amplification of the cells were completed;the cells were identified by immunohistochemistry,immunofluorescence,flow cytometry.Results:The cell culture showed colony-like growth at the first five days,and each single cell showed round or spindle-shaped.Two weeks later,the cellscovered the bottom of culture dish,and showed cobblestone-like appearance.Immunohistochemistry got 91.5% positive rate of CD31,72.4% positive rate of vWF;immunofluorescence staining told us that the cell emited red fluorescence,and phagocytose DiI-acLDL(+);but when the cells dyed with FITC marked by UEA-Ⅰ(+) they emited green fluorescence,and when the cells were double stained,they emited the yellow fluorescence.Flow cytometry analysis showed that the rate of CD34-positive cells was 93%,VEGFR-2 positive cells was 88.5%,and CD133 positive cells was 84.8%.Conclusions:CD34+、VEGFR-2+and CD133+endothelial progenitor cells can be largly obtained from the umbilical cord blood.

stem cells;progenitor cells;human umbilical cord blood

2015-12-16

安徽省自然科学基金项目(1308085MH164)；蚌埠医学院科研创新计划(Byycx1544)

单位] 蚌埠医学院第一附属医院1.肿瘤放疗科，2.中心实验室，233004

[作者简介] 赵梦蝶(1990-)，女，硕士研究生.

项平，硕士研究生导师，教授.E-mail：byxiangping@163.com

1000-2200(2016)09-1121-04

R 329.28

ADOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.09.001