诃子有效部位在体外模拟体内消化道环境抗氧化活性变化

夏德敏,江　浩,2,江慎华,2,*,谢丽琴,金洪光,张良慧,2,沈勇根,3,张爱琳,4

(1.九江学院药学与生命科学学院,江西九江 332000;2.九江安德和生物科技有限公司,江西九江 332005;3.江西农业大学食品科学与工程学院,江西省天然产物与功能食品重点实验室,江西南昌 330045;4.天津农学院食品科学与生物工程学院,天津 300384)



诃子有效部位在体外模拟体内消化道环境抗氧化活性变化

夏德敏1,江浩1,2,江慎华1,2,*,谢丽琴1,金洪光1,张良慧1,2,沈勇根1,3,张爱琳1,4

(1.九江学院药学与生命科学学院,江西九江 332000;2.九江安德和生物科技有限公司,江西九江 332005;3.江西农业大学食品科学与工程学院,江西省天然产物与功能食品重点实验室,江西南昌 330045;4.天津农学院食品科学与生物工程学院,天津 300384)

为了研究诃子有效部位在体外模拟体内主要消化道环境中抗氧化活性的变化趋势与规律,本文对诃子有效部位经体外模拟体内主要消化道环境(口腔、胃、小肠)中处理后抗氧化活性(总多酚、总还原力、FRAP法抗氧化能力、DPPH自由基清除能力及总抗氧化能力)的变化进行了研究。结果表明,经人工模拟口腔环境处理后,诃子有效部位抗氧化活性显著降低(总多酚、总还原力、FRAP法抗氧化能力和DPPH自由基清除能力p<0.01,总抗氧化能力p<0.05);经人工模拟胃环境处理后,其抗氧化活性显著提高(p<0.01);经人工模拟小肠环境处理后,其抗氧化活性显著降低(总多酚、总还原力、FRAP法抗氧化能力和DPPH自由基清除能力p<0.01,总抗氧化能力p<0.05)。本文为后续在体内环境进行功能食品实验提供参考。

诃子,有效部位,人工唾液,人工胃液,人工肠液,抗氧化活性

作为功能性食品原料,最终都要在体内发挥其功效[1]。食物经口腔咀嚼、胃及小肠消化,口腔中唾液淀粉酶及特定pH[2]、胃内蛋白酶及胃酸和小肠中的胰蛋白酶和胆汁盐对食物营养成分及功能活性均会产生影响[3]。大肠进一步吸收水分、贮存和排泄粪便等[2],对食物消化不起主要作用。

研究食品或药品在体内生物学活性所进行的体内实验,存在实验周期长、花费昂贵且对实验人员操作要求高,重现性有时可能存在一定变数。体外模拟体内消化道环境实验具有周期短、花费小、重现性高等优点[3-4]。在这种情况下,先在体外模拟体内主要消化道环境(口腔、胃和小肠)研究生物活性成分的变化规律,再进行体内实验,这样可极大增加后续体内实验成功概率。

诃子,为使君子科榄仁树属植物诃子(TerminaliachebulaRetz)的干燥成熟果实,诃子富含单宁酸、鞣花酸、三萜、黄酮及多酚类化合物等[5],具有许多生理功能(如治疗糖尿病、抗诱变、抗菌和抗病毒等[6])。国外有学者对诃子抑制血管紧张素转化酶活性[7]、鞣花酸衍生物抑制多磷酸盐激酶的表达[8]、没食子酸的分离与制备等方面展开了研究[9]。国内研究人员对诃子药理作用[10]、抗氧化作用[11]及多糖提取工艺进行了相关总结或研究[12]。本实验室前期研究发现乙酸乙酯部位为其抗氧化活性的有效部位[13]。但是,诃子功能活性在体内环境中将如何变化？目前还不清楚。导致在后续研发诃子功能食品做体内实验时不确定性因素增多。因此,本实验对诃子有效部位在体外模拟体内环境中抗氧化活性的变化情况进行研究,为增加后续体内实验成功率提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

诃子(无核)湖南省崇善堂中药饮片有限公司,产地广西,2014年4月5号包装,生产批号:140408。称取一定量诃子,低温烘干,趁脆性少量、多次粉碎后过60目筛获得干粉置干燥器中备用。三吡啶三吖嗪(2,4,6Tris(2-pyridy1)-s-triazine,TPTZ)及胆汁盐购自阿法埃莎(天津)化学有限公司;其余试剂均为国产分析纯或优级纯。

DFY-300摇摆式高速万能粉碎机温岭市林大机械有限公司;UNIC 7200型可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司;DL-5C型离心机上海安亭科学仪器厂;SHA-B恒温振荡器常州国华电器有限公司;RE-52型旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;PB-10 pH计Sartorius仪器设备有限公司。

1.2实验方法

1.2.1人工唾液、胃、肠液的配制

1.2.1.1人工唾液配制根据Madureira等方法[14]。采用1 mmoL/L 氯化钙溶液为溶剂配制100 U/mLα-淀粉酶,然后采用1 moL/L 碳酸氢钠溶液调pH至6.9得到人工唾液。

1.2.1.2人工胃液的配制根据江慎华等方法[3]。取浓度为1 mol/L的稀盐酸16.4 mL加800 mL蒸馏水和10 g胃蛋白酶,混合均匀后加水稀释至1000 mL调pH2.0。

1.2.1.3人工肠液配制根据Madureira等方法[14]。取0.1 mol/L碳酸氢钠为溶剂配制胰蛋白酶2 g/L(现用现配)和(牛)胆汁盐12 g/L混匀、盐酸调pH6.8即得。

1.2.2体外模拟口腔、胃、小肠环境对诃子有效部位抗氧化活性的影响

1.2.2.1诃子乙酸乙酯相的制备实验室前期工作基础表明,弱极性的乙酸乙酯相为其抗氧化活性的有效部位[15]。本实验采用相同的生物活性追踪法制备得到有效部位,供后续测定。

1.2.2.2模拟体内主要消化道环境处理方法模拟口腔处理:取诃子有效部位样液5 mL,唾液1.2 mL,pH6.9,于37 ℃、200 r/min水浴摇床中处理2 min。

模拟胃环境处理:取诃子有效部位样液5 mL,胃液12 mL,pH2.0,于37 ℃、130 r/min水浴摇床中处理2 h。

模拟小肠处理:取诃子有效部位样液5 mL,肠液12 mL,pH6.8,于37 ℃、145 r/min水浴摇床中处理2 h。

以上处理方法如表1所示

表1　体外模拟口腔、胃、小肠环境条件

以上对照组均采用蒸馏水代替人工唾液、人工胃液或人工肠液,其余操作相同。

以上处理结束后,用乙酸乙酯萃取10次,萃取液浓缩后采用甲醇定容至50 mL后置冰箱中备用。

1.2.3体外模拟体内主要消化道环境对诃子有效部位抗氧化活性的测定

1.2.3.1总多酚含量测定采用江慎华[3]、Abu Bakar等[16]方法,略有修改。取Folin试剂原液适量用蒸馏水稀释10倍。取该溶液2.25 mL加入到0.5 mL样液中,室温静置5 min,然后加入2.25 mL 6%的无水Na2CO3溶液,振荡摇匀35 ℃水浴90 min后在765 nm读数,以溶解样品的溶剂代替样液执行以上相同的操作调零。

1.2.3.2总还原力测定采用江慎华[3]、Gu等方法[17],略有修改。取0.5 mL样液于试管中,依次加入1.25 mL pH6.6、0.2 mol/L的磷酸缓冲溶液,1.25 mL 1% K3Fe(CN)6溶液试管中的溶液混匀50 ℃水浴20 min后迅速冷却,再加入1.25 mL 10%三氯乙酸溶液,依次加入4.25 mL蒸馏水、0.85 mL 0.1% FeCl3溶液,充分振荡后静置10 min,在700 nm处测其吸光光度值,以溶解样品的溶剂代替样液执行以上相同的操作调零。

1.2.3.3FRAP(Ferric Reducing Antioxidant Power)法抗氧化能力的测定采用江慎华[3]、Butsat等方法[18],略作改进,具体步骤如下。取150 μL样液,1.5 mL FRAP混合工作液,振荡均匀,37 ℃水浴反应40 min,在593 nm处测定吸光值。以溶解样品的溶剂代替样液执行以上相同的操作调零。

图1　诃子有效部位在体外模拟口腔环境抗氧化活性变化Fig.1　The antioxidant variation of the effective fraction of TCR in artificial saliva注:不同大写字母表示在α=0.01水平差异显著,小写字母表示α=0.05水平的显著性。

1.2.3.41,1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力的测定采用江慎华[3]等方法,略作改进,具体步骤如下。0.5 mL样液,1.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液(现用现配)振荡混匀,对照样为0.5 mL分析纯甲醇和1.0 mL 0.1 mmol/L DPPH混合,振荡摇匀,于30 ℃水浴中避光反应60 min后在517 nm处测定吸光值,以甲醇调零,DPPH自由基抑制率方程式计算如下:

式中:Y-抑制率(%);OD 517对照-517 nm处对照样品的吸光度值;OD 517样品-517 nm处不同浓度样品的吸光度值。

1.2.3.5总抗氧化能力的测定采用江慎华[3]、Pan等方法[19],略作修改。样液2.0 mL与5.0 mL混合液(28 mmol/L Na3PO4,4 mmol/L(NH4)6Mo4)振荡均匀,95 ℃水浴下保温1.5 h,695 nm处测其吸光度,以溶解样品的溶剂代替样液进行以上相同的操作调零。

以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene,BHT)及抗坏血酸VC为阳性对照。

实验重复三次,实验结果用平均值和标准差表示。

1.3数据统计分析

采用DPS软件进行方差分析。

2　结果与分析

本实验通过测定总多酚含量、总还原力、总抗氧化能力、FRAP法抗氧化能力及DPPH自由基清除能力变化来评价诃子有效部位抗氧化活性在体外模拟体内口腔、胃及小肠环境对其影响。

图2　诃子有效部位在体外模拟胃环境抗氧化活性变化Fig.2　The antioxidant variation of the effective fraction of TCR in artificial gastric juice注:不同大写字母表示在α=0.01水平差异显著,小写字母表示α=0.05水平的显著性。

2.1体外模拟口腔环境对诃子有效部位抗氧化活性的影响

食物服用后首先经过口腔,主要受唾液淀粉酶影响[2]。诃子有效部位抗氧化活性在模拟口腔中的变化测定结果如图1(a-e)所示。

由该图可见,诃子有效部位经体外模拟口腔环境处理后,其抗氧化活性均显著降低(p<0.05、p<0.01)。与对照相比,口腔环境处理样总多酚含量下降了0.042、总还原力降低了1.3倍、FRAP法抗氧化能力减少了0.043和DPPH自由基清除率下降了41.12%,并且对照的总抗氧化能力是口腔环境处理后的1.2倍。

黄酮和多酚类化合物被认为是植物抗氧化活性的主要物质基础[20]。其化合物化学结构及取代基的位置基本决定了它们抗氧化效果,蛋白质可与多酚类化合物通过氢键与发生作用[21]。陈磊等[21]发现α淀粉酶对黄酮抗氧化活性有抑制作用。本实验中诃子有效部位在体外模拟口腔环境中抗氧化活性降低的原因也可能是α淀粉酶与多酚结合而抑制了其抗氧化活性。

2.2体外模拟胃环境对诃子有效部位抗氧化活性的影响

食物经口腔咀嚼后随食道进入胃内,这时主要受胃酸及胃蛋白酶的影响[3]。体外模拟体内胃环境对诃子有效部位抗氧化活性影响的测定结果如下。

由图2(a-e)可见,经模拟胃环境处理后,抗氧化活性均显著升高(p<0.01),具体升高幅度如表2所示。诃子有效部位经胃环境处理后抗氧化活性升高可能是:1. 胃酸和消化酶有助于多酚的释放,并且多酚在胃体酸性条件下更稳定[22-23];2.诃子有效部位中部分多酚或黄酮类化合物在低pH胃液环境中发生水解、一些苷类化合物变成了相应的苷元,而苷元一般都具有比糖苷更强的抗氧化活性的缘故[3,24]。Bouayed等[22]也发现,经体外模拟体内胃环境处理后苹果抗氧化活性也显著增强。

2.3体外模拟肠环境对诃子有效部位抗氧化活性的影响

服用的食物经胃处理后会进入小肠继续消化。诃子有效部位在体外模拟体内小肠环境中抗氧化活性的变化进行了测定,结果如下(图3,a-e)。

图3　诃子有效部位在体外模拟小肠环境抗氧化活性变化Fig.3　The antioxidant variation of the effective fraction of TCR in artificial intestinal juice注:不同大写字母表示在α=0.01水平差异显著,小写字母表示α=0.05水平的显著性。

诃子有效部位经体外模拟体内小肠环境处理后抗氧化活性变化结果如图3、表2所示。诃子有效部位其抗氧化活性(总多酚、总还原力、FRAP抗氧化能力、DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力)经体外模拟体内小肠环境处理后均显著性降低。诃子有效部位经模拟小肠环境及上述2.1中模拟口腔抗氧化活性均显著性降低,可能的原因是多酚在小肠和口腔pH条件下不稳定、易分解;其次,多酚也可能转化为其它化学物质[21]。Rodríguez-Roque等[25]也发现,豆浆多酚和异黄酮在人工模拟小肠环境中抗氧化活性(总多酚和DPPH清除率)也显著降低,与本文测定结果相似。

2.4诃子有效部位经人工模拟口腔环境、胃环境及小肠环境处理后抗氧化活性变化情况

经人工模拟口腔环境、胃环境及小肠环境处理后,诃子有效部位抗氧化活性具体变化情况由表2可知,诃子有效部位在人工胃环境处理后,抗氧化活性显著性升高。其中,与对照相比,经胃环境处理后诃子有效部位总多酚含量升高到1.4倍(p<0.01),总还原力(OD700)上升了0.023。FRAP法抗氧化能力(OD593)增加了0.085;DPPH自由基清除率提高了8.51%(p<0.01);总抗氧化能力(OD695)提高了0.045。

表2　诃子有效部位在体外模拟口腔环境、胃环境、小肠环境抗氧化活性变化

注:相同列不同字母代表各样品之间存在显著性差异,p<0.01。如表2所示。

3　结论

诃子有效部位抗氧化活性(总多酚、总还原力、FRAP法抗氧化能力和DPPH自由基清除率)经模拟消化道环境处理后变化呈现如下规律:

经体外模拟口腔环境处理后,抗氧化活性显著性降低(总多酚、总还原力、FRAP法抗氧化能力和DPPH自由基清除能力降低显著性水平为p<0.01,总抗氧化能力降低显著性水平为p<0.05)。可能是因为α淀粉酶与多酚结合而抑制了其抗氧化活性。

经体外模拟胃环境处理后,抗氧化活性显著性升高(p<0.01)。可能是因为胃酸和消化酶有助于多酚的释放,并且多酚在胃酸的条件下更稳定,胃酸对于抗氧化活性的增强有促进作用;同时,胃酸将诃子有效部位中黄酮苷类化合物水解成抗氧化活性更高的苷元的缘故。

经小肠处理后,抗氧化活性显著性降低(总多酚、总还原力、FRAP法抗氧化能力和DPPH自由基清除能力降低显著性水平为p<0.01,总抗氧化能力降低显著性水平为p<0.05)。可能的原因是因为多酚在小肠pH条件下不稳定,易分解;其次,多酚也可能转化为其它化学物。

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Variation of antioxidant activities of the effective fraction fromTerminaliachebulaRetz in simulatedinvivodigestive tracts

XIA De-min1,JIANG Hao1,2,JIANG Shen-hua1,2,*,XIE Li-qin1,JIN Hong-guang1, ZHANG Liang-hui1,2,SHEN Yong-gen1,3,ZHANG Ai-lin1,4

(1.School of Pharmacy and Life Science,Jiujiang University,Jiujiang 332000,China; (2.Jiujiang Andehe Biotechnology Co.,Ltd,Jiujiang 332005,China; (3.College of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University,Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Foods,Nanchang 330045,China; 4.Department of Food Science and Biotechnology,Tianjin agricultural University,Tianjin 300384,China)

In order to study the antioxidant variation of the effective fraction from TCR in simulatedinvivodigestive tract environment,the effective fraction from TCR were immersed by conditions of mainly digestive tract(mouth,stomach and small intestine). The antioxidant activities of the effective fraction from TCR were studied by measuring total polyphenols,total reducing power,ferric reducing antioxidant power,free radical scavenging activity of DPPH and total antioxidant. The results indicated that antioxidant activities of the effective fraction of TCR were significantly reduced after immersed by artificial saliva(total polyphenols,total reducing power,ferric reducing antioxidant power,free radical scavenging activity of DPPHp<0.01,total antioxidantp<0.05). While its antioxidant capacities were conspicuously increased after by artificial gastric juice(p<0.01). Last,its antioxidant capacities were remarkably declined after immersed by artificial intestinal juice(total polyphenols,total reducing power,ferric reducing antioxidant power,free radical scavenging activity of DPPHp<0.01,total antioxidantp<0.05). This study offered the reference for further research of functional foodinvivo.

TerminaliachebulaRetz;effective fraction;artificial saliva;artificial gastric juice;artificial intestinal juice;antioxidant activity

2016-02-02

夏德敏(1992-)，男，本科，研究方向：天然产物开发与研究，E-mail：541244673@qq.com。

江慎华(1973-)，男，博士，副教授，研究方向：天然产物研究与开发，E-mail：jiangshenhua66@163.com。

国家自然科学基金(31360371，31560308)；江西省自然科学基金(20132BAB204030)；江西省科技支撑计划(20123BBF60150、20151BBF60026)；江西省卫生厅科研计划(2013A017)；江苏省农产品物理加工重点实验室开放课题(JAPP2010-5)；江西省天然产物与功能食品重点实验室开放基金资助项目；九江市科技支撑计划(201438)；九江学院教学改革研究课题(2015-04)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)17-0326-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.055