利用油料籽粕酶法制备多肽工艺及其抗氧化活性研究进展

唐天悦,周海玥,姜　婧,宋立华,*

(1.上海交通大学 农业与生物学院,陆伯勋食品安全研究中心,上海 200240；2.雀巢研发中心上海有限公司,上海 201812)



利用油料籽粕酶法制备多肽工艺及其抗氧化活性研究进展

唐天悦1,2,周海玥1,姜婧1,宋立华1,*

(1.上海交通大学 农业与生物学院,陆伯勋食品安全研究中心,上海 200240；2.雀巢研发中心上海有限公司,上海 201812)

油料籽粕经过酶水解可制备具有生物活性的多肽,其中部分多肽具有抗氧化活性。籽粕原料来源及水解工艺不同,活性肽的抗氧化活性也有所差别。本篇综述介绍目前国内外利用花生、大豆和油菜籽等主要油料籽粕原料酶解制备抗氧化活性肽的工艺方法及其抗氧化活性。

油料籽粕,酶解工艺,生物活性肽,抗氧化活性

根据联合国粮农组织(UNFAO)的调查数据,2014～2015年度油籽的总产量约5.4亿t,榨油之后的副产物油粕粉和油粕饼的利用率(利用量与供应量之比)为82.5%[1],目前,油料作物榨油后的副产物——籽粕,如花生粕、玉米渣和大豆粕等,炼油之后一般都被丢弃或用作廉价的动物饲料。事实上,常见油料籽粕中含有至少35%以上的蛋白质(如表1所示),且氨基酸组成平衡[2],是重要的植物蛋白资源。Hwang JY等[3]的研究表明,利用酶水解花生粕后获得的多肽较籽粕蛋白在抑制亚麻酸过氧化作用中具有更强的抗氧化活性;更为重要的是,与其他抗氧化食品添加剂相比,籽粕活性多肽在pH为2～12、温度为30～80 ℃的范围内,均显示出较好的溶解性和活性[4]。因此,利用现代生物技术对这些籽粕中的蛋白质进行综合开发利用,生产活性多肽,不仅可减少浪费,还可开发出具有高附加值的生物活性物质。

表1　我国2012年油料作物产量、籽粕产出量*以及蛋白质含量

注:*中国国家统计局年鉴2013 http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj/2013/indexch.htm；**2012年我国大豆的进口数量为5838万t。

表2　部分油料籽粕蛋白的最佳水解条件

目前,利用动、植物来源的蛋白质制备活性肽的方法有酶水解及生物发酵等方法[5]。其中,因为酶法具有较好的专一性,故而在实际生产中得到广泛应用。在活性肽的酶解制备工艺中,蛋白质来源、氨基酸序列、工艺条件不同,最终获得的籽粕活性多肽的活性也有所不同。此外,研究表明有些活性多肽对心血管系统、消化系统、免疫系统和神经系统等发挥有益作用[6],其中,具有抗氧化活性的多肽通过抑制羟基自由基、超氧阴离子等自由基的活动,减轻脂质过氧化反应,从而发挥延缓衰老、抗肿瘤及减轻心血管疾病等作用[7]。近年来,抗氧化活性肽的制备工艺及其生物学活性的研究一直受到关注。本文主要综合论述以花生粕、大豆粕和油菜籽粕为原料,利用酶法制备活性多肽工艺方法及其抗氧化生物活性研究进展。

1　籽粕活性多肽的酶法制备工艺

目前,利用籽粕制备活性多肽的方法主要有直接提取、生物发酵和酶水解等[5]。由于蛋白质结构、分子量以及氨基酸序列不同,所采取的制备工艺也有所不同。其中,直接提取的活性多肽一般天然存在于植物中,如银杏种子、芹菜和山药块茎等,其多肽分子量在30 ku以下,可用离子交换或者排阻色谱法进行提取纯化[8-10];利用微生物发酵肉酱、大豆和牛奶也可以获得活性多肽[11-13];大麻籽活性多肽则是利用胃蛋白酶和胰蛋白酶经体外水解后,再利用超滤分离获得不同分子量的活性多肽[14],在上述各种工艺中酶水解法应用较多。

1.1酶水解法工艺流程

利用酶法从籽粕中提取制备活性多肽的一般工艺为:籽粕粉碎过筛→提取蛋白→80～100 ℃热水浴处理→调节pH→酶水解→高温灭酶→分离纯化或超滤→浓缩→冷冻干燥→多肽→检测多肽的生物学活性[15-17]。在制备活性多肽的工艺中,前处理中通过加热煮沸籽粕,可破坏蛋白质紧密的球状空间结构,有利于蛋白酶与蛋白结合位点的接触,从而加快酶解速度[17]。

1.2酶的选择

目前,利用籽粕水解制备活性肽的酶制剂主要有:碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶等[15,18-19],其中碱性蛋白酶和中性蛋白酶最为常用。在蛋白酶推荐的最适宜作用条件下,碱性蛋白酶酶解花生粕、大豆粕和油菜籽粕后水解产物的抗氧化活性最高[15,18-19]。这可能是与蛋白酶的作用位点密切相关,如有研究表明碱性蛋白酶的水解氨基酸残基位点为谷氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸及谷氨酰胺的羧端肽键;而中性蛋白酶仅水解羧基端为酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸等芳香族疏水性氨基酸的肽键[20]。因此,利用植物蛋白水解制备活性肽时,选用碱性蛋白酶可能更合适,因为其对羧端疏水性氨基酸具有较强的专一性,表现为经碱性蛋白酶水解后,能获得较多分子量小于10 ku的肽,由于水解相对彻底,获得的肽链短,游离氨基酸残基较多,故抗氧化能力较强[21]。

1.3水解条件的选择

在水解条件方面(包括pH、水解温度、底物的量、酶制剂添加量),中性和碱性蛋白酶水解各类籽粕的最佳水解条件如表2所示,从表中数据可看出,作用底物不同,两种蛋白酶的最佳水解条件有所不同:与中性蛋白酶相比,总体上碱性蛋白酶的作用温度偏高;其次,同样来源的植物蛋白,经碱性蛋白酶处理的水解度高于中性蛋白酶[22-24],碱性蛋白酶处理后花生粕、大豆粕以及油菜籽粕的水解度在14%～25%。而中性蛋白酶水解之后的籽粕的水解度仅为5%～15%[22-24];此外,在水解时间方面,研究表明水解2 h之后,籽粕溶液水解度的上升趋于缓和,3 h之后水解几乎不再进行[21]。

因此,在酶解制备活性多肽的实际生产工艺中,可根据所需多肽分子量等要求,合理选择酶制剂和酶解时间,以简化生产工艺,降低生产成本[25]。

2　籽粕活性多肽的抗氧化活性

2.1多肽抗氧化活性的影响因素

多肽具有多种活性,其中抗氧化活性是多肽的生物学活性之一。已有部分结果证明分子量在13 ku之内的多肽具有较好的抗氧化活性[26];此外,Pihlanto-Leppälä[27]指出,肽链末端氨基酸种类会影响肽的生物学活性,一般地,甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸被认为是抗氧化氨基酸[28]。Garcia[5]和Sila等人[29]分别比较了上百种植物蛋白和数十种鱼类蛋白水解后的肽链结构及其抗氧化活性,结果表明具有含有上述抗氧化氨基酸残基的肽链具有较高的抗氧化活性。然而,另有研究表明,尽管多肽链具有相同种类的氨基酸,其抗氧化活性却不尽相同,如有研究对猪脑蛋白在不同条件下进行酶解处理后得到不同的多肽,测得这些多肽的各氨基酸比例相同,但这些多肽在相同浓度下,抗氧化活性却具有显著差异,研究推测这可能是由于多肽链的分子量及亲水性有所不同所致,但该研究只给出了肽链氨基酸比例和肽链大小分布,并未提及肽链的亲水情况及肽链结构式[28];另外,Je[30]和Kim等人[31]证明有些不含上述氨基酸残基的多肽链,亦有较好的抗氧化活性。上述研究结果提示氨基酸残基的种类对多肽抗氧化活性的影响尚有待于进一步研究。

值得注意的是,除了多肽中抗氧化氨基酸残疾的种类,这些氨基酸残基的位置也会导致其抗氧化活性的变化,Chen[32]研究了28种多肽的抗氧化活性,结果表明在肽链C末端缺失组氨酸会降低抗氧化活性,如果N末端缺失亮氨酸却对抗氧化活性无影响,这进一步提示抗氧化氨基酸残基在C端还是N端对多肽的抗氧化活性亦有影响。某些以二肽形式结合的氨基酸,比他们单独存在时要表现出更强的抗氧化活性[33-34]。此外,多肽的某些结构构象也会降低多肽的抗氧化活性,比如,将多肽链中第二个L-组胺酸换成了D-组胺酸,其抗氧化活性则会下降60%[35-36]。由此可见,多肽的抗氧化活性与其分子量、氨基酸残基种类、残基位置以及构象等有关。

表4　籽粕活性多肽对大鼠血红细胞及肝细胞的体外抗氧化作用

2.2籽粕活性多肽的体外抗氧化活性

表3　不同浓度籽粕活性多肽的体外抗氧化活性

多肽体外抗氧化能力还可通过检测红细胞的溶血率和丙二醛(MDA)抑制率等方法进行评估。研究显示,油料籽粕活性多肽可在红细胞受到氧化物(例如:过氧化氢)攻击时,利用其自身的抗氧化性,使红细胞的细胞膜免受氧化损伤而减少细胞膜的破裂(表现为红细胞溶血率的降低)[15];薛照辉[38]的研究表明,油菜籽粕活性多肽可通过抑制肝细胞中脂质过氧化反应,抑制脂质过氧化反应终产物MDA的生成(表4)。

在多肽的抗氧化活性评价方面,也有人将籽粕活性多肽添加入食用油脂中以替代常规抗氧化剂,观察其对油脂氧化的抑制作用。王建化等人[22]在猪板油里添加花生肽,通过检测油脂的过氧化值观察花生肽(5%)的抗氧化效果,结果表明猪板油在70 ℃下保存12 d,其过氧化值(POV)较对照组降低五倍,抗氧化效果与3%维生素E的抗氧化效果相当;Hwang JY等人[39]的结果表明:1.0 mg/mL花生籽粕活性多肽与0.02 mg/mL BHA具有相同的抗氧化能力,提示花生籽粕来源的多肽具有一定的抗氧化活性。另有研究表明大豆籽粕多肽浓度小于0.1%时,其在大豆油和菜籽油中的抗氧化活性显著低于叔丁基对苯二酚(0.02%),随着大豆籽粕多肽使用量的增加,其抗氧化作用增强;但添加量加倍后,油脂过氧化值(POV)值未见进一步明显降低。即使在大豆油和菜籽油中添加0.1%的大豆籽粕多肽,其对POV值的影响仅相当于0.04%茶多酚的2倍[18]。

上述研究结果表明,多肽的抗氧化活性与其原料来源密切相关,即来源不同,其发挥抗氧化活性的有效浓度有所不同;抗氧化活性的评估方法不同,其表现也不尽相同。另外,籽粕来源的活性多肽,虽然在清除氧自由基和延缓脂质过氧化等方面都有一定效果,但作为抗氧化剂应用于食用油中尚有一定的局限性,根据现有研究结果,将籽粕多肽作为抗氧化剂应用植物油,不但添加量较高,抗氧化效果有限,而且不同来源的籽粕活性多肽对不同植物油的抗氧化效果也还需要更多的实验数据进一步评估。

2.3籽粕活性多肽的体内抗氧化活性

为进一步研究籽粕多肽的体内抗氧化活性,有研究利用D-半乳糖建立衰老大鼠模型,并灌胃给予大鼠花生籽粕多肽(500 mg/kg ·体重),连续喂养50 d后,可以使大鼠血清和脑组织中的SOD活性显著增加,其中,大鼠脑组织SOD活性较衰老模型组增加14.5%,血清SOD活性增加7.7%[40]。给大鼠每日灌胃给予400 mg/kg ·体重大豆籽粕多肽,45 d之后,其肝组织的SOD活性量较模型组增加15.2%[18]。

另有体内研究结果表明,D-半乳糖所致衰老组大鼠脑组织CAT活性较正常组大鼠降低50%,而每日灌胃给予剂量为400 mg/kg·体重的大豆籽粕多肽,连续喂养45 d后,大鼠脑组织的CAT活性较衰老模型组高41.6%[18];且大豆籽粕多肽干预剂量低于400 mg/kg·体重时,随多肽剂量的增加脑及肝组织中CAT活性显著增加;但当大豆籽粕多肽的干预剂量超过400 mg/kg·体重之后,CAT活性未见明显增强[18]。

在对脂质过氧化物的作用方面,D-半乳糖致衰老大鼠脑组织MDA水平较正常组大鼠升高29.4%,而在大豆籽粕多肽干预组(400 mg/kg·体重,45 d)MDA水平较衰老模型组降低10.3%,肝组织的MDA则降低16.8%[18]。利用花生籽粕多肽(500 mg/kg·体重)对同类衰老大鼠进行干预50 d后,大鼠血清MDA含量可较衰老模型降低39.5%[40]

上述研究表明,花生和大豆籽粕多肽对衰老大鼠的脑、肝脏和机体均表现出一定的抗氧化活性,但与花生和大豆籽粕多肽相比较而言,菜籽多肽的体内抗氧化效果并不是非常显著[41],可见多肽在体内的抗氧化活性与其制备的原料来源、种类及作用剂量密切相关。

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Research progress in enzymic preparation of oil crop meal peptides and its antioxidant activity

TANG Tian-yue1,2,ZHOU Hai-yue1,JIANG Jing1,SONG Li-hua1,*

(1.Bor S. Luh Food Safety Research Center,School of Agriculture & Biology, Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China; 2.The nestle research center in Shanghai co.,LTD,Shanghai 201812,China)

Bioactive peptides from de-fatted oil crops meal can be prepared using enzyme hydrolysis,and some of them has anti-oxidative activity. These peptides obtained under different hydrolysis condition and from different categories of oil crop meal have been shown to possess different radical scavenging and lipid oxidation inhibition abilities. Our present review summarized the enzymatic process and antioxidant activities of peptides from oil crops meal as peanut,soybean and rapeseed.

oil crop meals;enzymatic hydrolysis;bioactive peptides;antioxidant activity

2016-01-27

唐天悦(1986-)，女，在读农业推广硕士研究生，研究方向：食品营养，E-mail:397728089@qq.com。

宋立华(1970-)，女，博士，副教授，研究方向：食品加工与营养，E-mail：lihuas0529@163.com。

国家自然科学基金(30972460)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)17-0390-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.069