杏鲍菇发酵液对3种植物病菌的抑制作用

侯潞丹，吴　颖，张　杰

(山西师范大学 生命科学学院，山西 临汾 041004)



杏鲍菇发酵液对3种植物病菌的抑制作用

侯潞丹，吴颖，张杰*

(山西师范大学 生命科学学院，山西 临汾 041004)

杏鲍菇是一种重要的具有食用价值和药用价值的真菌，其发酵液中含有大量的次级代谢产物。文章初步探究了杏鲍菇发酵液对尖镰孢菌、链格孢菌、禾谷镰孢菌3种植物病菌的抑制作用。结果表明：发酵液使3种病菌菌丝均表现出溶菌现象；发酵液原液对3种病菌菌丝生长速度及孢子萌发影响最大，其抑菌率依次为尖镰孢菌(92.78%)>链格孢菌(89.76%)>禾谷镰孢菌(87.45%)；其孢子萌发抑制率依次为禾谷镰孢菌(79.45%)>链格孢菌(72.25%)>尖镰孢菌(52.32%)。由此可见，杏鲍菇发酵液中的确存在对植物病菌有抑制作用的物质，进而为生物制剂的开发提供依据。

杏鲍菇发酵液；植物病害菌；抑制作用

食用菌是一种重要的生物资源，其液体发酵可以在短时间内获得大量菌丝体及其代谢产物，由于这一过程周期短、产量高、成本较低，因此在食用菌生产中具有广阔的应用前景[1]。食用菌菌渣是食用菌栽培过程中收获产品后剩下的培养基废料，其中含有大量的菌丝残体、纤维素、半纤维素等物质，特别是含有大量食用菌次级代谢产物。它常可用于栽培基质、作物基肥、饲料添加物等[2-3]。陈庆榆等[4]研究表明，一定比例的菌渣施用可促进青菜生长，提高产量。马嘉伟等[5]探究得出菌渣化肥配施可显著提高稻谷生物量和稻谷产量，郑宁等[6]也得出了相似的结论；胡清秀等[7]则发现，适量的菌渣可以减少稻谷空瘪粒，提高水稻产量，但他们并没有对其具体缘由作出探究。杨昌跃等[8]研究得出有30株不同真菌的代谢产物对烟草黑胫病具有较强的抑制作用。因此，对真菌代谢产物进行研究具有重要意义。

链格孢菌(Alternaria alternata)、尖镰孢菌(Fusarium oxysporum .f.sp.cucmrium)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)是3种常见真菌病原菌，其可通过菌丝及孢子进行快速繁殖，且在适宜条件下可快速侵染植株使其致病。其寄主范围广、对环境和基质的适应性强且广泛分布，是重要的植物病原菌[9]。对于这3种植物病菌引起的疾病目前多采用化学制剂的防治方法，但是长期使用会破坏生态平衡。因此，生物防治迫在眉睫。目前，有关食用菌代谢物对植物病菌进行生物防治的研究报道极少。因此，本试验探究了杏鲍菇发酵液对3种病菌的防治效果，不仅为这3种病菌的生物防治提供依据，而且为食用菌资源的开发利用及生物制剂的开发提供依据。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1供试菌株

杏鲍菇(Pleurotus eryngii)菌种，购自于四川省农业科学院微生物研究中心。

尖镰孢菌(Fusarium oxysporum .f.sp.cucmrium)、链格孢菌(Alternaria alternata)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)由山西师范大学生命科学学院培养保存。

1.1.2培养基的配制

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，水1 000 mL，pH值自然。

摇瓶种子培养基：马铃薯200 g，麸皮40 g(煮汁)，葡萄糖20 g，MgSO41.0 g，KH2PO41.5 g，水1 000 mL，pH值自然[10]。

液体发酵培养基：马铃薯100 g，麸皮30 g，红糖15 g，葡萄糖11 g，蛋白胨1.5 g，MgSO40.9 g，KH2PO41.5 g，水1 000 mL，pH值自然。

1.2试验方法

1.2.1摇瓶种子的制备

在无菌条件下，从活化好的斜面菌种中挑取3块大小均匀的菌块，接入摇瓶种子培养基中，26℃、120 r·min-1摇床振荡培养6 d获得摇瓶种子。

1.2.2发酵液的制备

按10%的接种量，将摇瓶种子接入发酵培养基中，其发酵培养基摇瓶为250 mL的三角瓶，装液量为100 mL，26℃，120 r·min-1摇床振荡培养6 d。采用无菌操作技术，取液体发酵培养基各30 mL于50 mL离心管中，于5℃，4 000 r·min-1条件下离心20 min，所得上清液即为杏鲍菇发酵液。

1.2.3搭片培养3种病菌

以加有发酵液的PDA培养基为实验组，以加无菌水的PDA培养基为对照组，采用搭片法对3种植物病菌进行搭片培养5 d，共聚焦显微镜进行形态观察。

1.2.4菌丝生长速度的测定

在无菌条件下，取制备好的不同浓度发酵液5 mL，加入到无菌培养皿中，且将冷却至45℃的PDA培养基倒入培养皿15 mL，每皿共20 mL，待其凝固后备用。以无菌水为对照。

取病菌菌种分别接种到制备好的培养基平板上，每个培养皿接种1个菌饼，每组3次重复，以无菌水为对照；28℃培养5 d，采用十字交叉法测量菌落直径。

菌落纯生长量(D)、抑制率(P)的计算公式分别为：

D=d1-d2

P=(D1-D2)/ D1× 100%

式中：d1—菌落平均直径(cm)；d2—菌饼直径(cm)；D1—对照纯生长量(cm)；D2—处理纯生长量(cm)[11]。

1.2.5孢子萌发抑制率的测定

采用盖玻片培养法[12]，将3种植物病菌接种至PDA斜面，培养7 d，使其产生大量孢子，备用；将10 mL无菌水加入到试管内，反复吹打，制备孢子悬浮液，再将孢子悬浮液适当稀释，直至在400倍显微镜视野下观察到50～100个孢子为宜；将制备好的发酵液分别稀释10，100倍备用。孢子悬浮液与粗提液各取5 mL分别加入培养皿中，再取盖玻片于培养皿中。以无菌水为对照，每组4次重复，12℃培养14 h。显微镜检孢子萌发数。

孢子萌发抑制率=(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100%[13]

2　结果与分析

2.1发酵液对尖镰孢菌、链格孢菌、禾谷镰孢菌菌丝形态的影响

取发酵液处理5 d的3种植物病菌菌丝，共聚焦显微镜观察，结果如图1所示：链格孢菌实验组菌丝生长不正常，图中红色箭头表明其菌丝发生扭曲变形且多处断裂；尖镰孢菌实验组与对照组相比较：实验组菌丝多处溶断，菌丝形态不完整；禾谷镰孢菌对照组菌丝生长正常，粗细均匀，孢子呈现镰刀状，而实验组菌丝发生弯曲并多处溶断，且菌丝畸形，不能正常生长。

2.2发酵液对尖镰孢菌、链格孢菌、禾谷镰孢菌菌丝生长速度的抑制作用

表1数据显示，杏鲍菇发酵液对尖镰孢菌、链格孢菌、禾谷镰孢菌的菌丝生长速度均有显著的抑制作用，抑菌率分别为92.78%，89.76%，87.45%；3种植物病菌菌落纯生长量从大到小依次为禾谷镰孢菌0.97 cm·d-1、链格孢菌0.43 cm·d-1、尖镰孢菌0.33 cm·d-1。

从图2可以得出：不同浓度的杏鲍菇发酵液对链格孢菌、尖镰孢菌及禾谷镰孢菌的菌丝生长速度均有显著的抑制作用，且随着发酵液浓度的升高，菌落生长速度明显减缓。同时由图可得在平板培养5 d后，3种植物病菌不同处理组之间菌落大小均表现出显著性差异(P<0.05)，由此得出：不同浓度发酵液对菌丝生长速度的抑制作用从大到小依次为原液、稀释10倍、稀释100倍、水。

图中红色箭头所指为菌丝扭曲或溶断处图1　三种植物病菌菌丝显微图(400×)Fig.1　The microscope images of the 3 fungi(400×)

表1发酵液对菌丝生长的抑制作用

Table 1Inhibition effect of fermented filtrates on the mycelia growth

菌种名称菌落纯生长量/(cm·d-1)抑菌率/%尖镰孢菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucmrium)0.3392.78链格孢菌(Alternariaalternata)0.4389.76禾谷镰孢菌(Fusariumgra-minearum)0.9787.45

2.3发酵液对尖镰孢菌、链格孢菌、禾谷镰孢菌孢子萌发的抑制效应

表2表明，随着发酵液浓度的升高，尖镰孢菌孢子萌发率越低。与CK相比，当发酵液稀释100倍时，尖镰孢菌孢子萌发率显著降低，此时孢子萌发率为41.42%；当其发酵液稀释10倍时，孢子萌发率为39.65%，两组间孢子萌发率差异性不大；当使用未经稀释的发酵液时，孢子萌发率降低至30.23%，与稀释10倍、稀释100倍组相比差异显著。由表2可知，不同浓度发酵液对尖镰孢菌孢子的抑制率从大到小依次为：原液(52.32%)、稀释10倍(37.93%)、稀释100倍(34.67%)。

图中同一种菌不同处理间没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)图2　不同浓度发酵液对3种植物病菌菌落大小的影响Fig.2　Effect of different concentrations of fermented filtrates on the size of colony of 3 fungi

表2发酵液对尖镰孢菌孢子萌发的抑制效应

Table 2Inhibition effect of different concentrations of fermented filtrates on spore germination of Fusarium oxysporum f.sp.cucmrium

发酵液稀释倍数孢子平均萌发数萌发率/%萌发抑制率/%原液22.67±9.0230.23±5.27c52.32稀释10倍30.00±2.0039.65±1.57b37.93稀释100倍33.00±9.6441.42±6.09b34.670(CK)58.33±5.1363.40±7.76a0

注：表中同列不同行数据后没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

由表3可知，发酵液对链格孢菌孢子萌发的抑制作用的随着浓度的升高而增强。当发酵液稀释100倍时，孢子萌发率为38.63%，与CK相比显著降低；当其发酵液稀释10倍时，孢子萌发率降低至24.85%；当其发酵液为原液时，链铬孢菌孢子萌发率显著降低至23.40%，与CK的萌发率(71.28%)相比较差异显著。同时由表3可以得出，不同浓度对链格孢菌孢子萌发的抑制作用依次为原液(72.25%)、稀释10倍(65.14%)、稀释100倍(45.81%)。

表3发酵液对链格孢菌孢子萌发的抑制效应

Table 3Inhibition effect of different concentrations of fermented filtrates on spore germination of Alternaria alternata

发酵液稀释倍数孢子平均萌发数萌发率/%萌发抑制率/%原液9.33±2.0823.40±5.70c72.25稀释10倍12.33±1.1524.85±1.96c65.14稀释100倍22.33±1.5338.63±4.36b45.810(CK)54.00±4.5871.28±4.10a0

表4表明，发酵液对禾谷镰孢菌孢子萌发的抑制效果极为明显，发酵液浓度越高，抑制作用越显著，且各组之间萌发率均有显著性差异(P<0.05)。当发酵液稀释100倍时，孢子萌发平均数为19.67，萌发率75.77%，抑制率为20.76%；当稀释10倍时，孢子萌发平均数为16.67，萌发率降低为32.76%，萌发抑制率高达65.74%；当发酵液为原液时，孢子萌发平均数仅为10.33，萌发率最低为19.65%，其抑制率最高为79.45%。

表4发酵液对禾谷镰孢菌孢子萌发的抑制效应

Table 4Inhibition effect of different concentrations of fermented filtrates on spore germination of the Fusarium graminearum

发酵液稀释倍数孢子平均萌发数萌发率/%萌发抑制率/%原液10.33±2.5219.65±6.43d79.45稀释10倍16.67±3.2132.76±5.19c65.74稀释100倍19.67±4.7375.77±7.89b20.760(CK)57.67±1.5395.62±1.71a0

3　结论与讨论

本试验表明，杏鲍菇发酵液对3种病菌菌丝均表现出溶菌现象，菌丝细胞壁结构遭到破坏，原因可能是由于发酵液中含有与该病菌相应的胞壁降解酶等物质，使病菌菌丝细胞壁溶解断裂，破坏了其正常结构，导致其不能正常生长，进而在一定程度上抑制了病菌菌丝的繁殖。

同时试验结果表明，发酵液原液对3种病菌菌丝生长速度及孢子萌发影响很大，其抑菌率依次为尖镰孢菌(92.78%)>链格孢菌(89.76%)>禾谷镰孢菌(87.45%)；其孢子萌发抑制率依次为禾谷镰孢菌(79.45%)>链格孢菌(72.25%)>尖镰孢菌(52.32%)。由此可得杏鲍菇发酵液中可能含有抗菌物质，该物质对这3种植物病菌的孢子萌发抑制作用显著，从根源上对病菌的繁殖进行了抑制。

韩燕峰等[14]通过平板抑菌实验探究得出蛹虫草菌株发酵液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有一定抑制作用；杨雯雯等[15]研究了真姬菇发酵液的抑菌活性，得出其发酵液对6种细菌有一定的抑制作用，对枯草芽孢杆菌和4种霉菌基本无抑制作用；周金凤等[16]探究得出灵芝培养基发酵液粗提物对苹果炭疽病菌、小麦根腐病菌和西瓜枯萎病菌具有显著的抑菌活性，本试验得出了与其相似的结论，证明了杏鲍菇发酵液中存在抑菌活性物质。且据报道，食用菌发酵液中的有效抑菌成分主要是一些小分子质量的蛋白、多肽、多糖、有机酸、挥发油倍半萜、酚和有机酸类物质等[17-18]，但是由于目前国内外有关食用菌发酵代谢产物抑菌作用的研究报道极少，因此本研究从新的角度来研究真菌，为其开发利用提供了依据。由于杏鲍菇在发酵过程中会产生多种次级代谢产物，我们只对其进行了初期的研究，对其构效关系和机理并不清楚，需要进一步的探索和研究。

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(责任编辑张韵)

Inhibition effect of fermented filtrates of Pleurotus eryngii on 3 plant fungi

HOU Lu-dan，WU Ying，ZHANG Jie*

(College of Life Sciences，Shanxi Normal University，Linfen 041004，China)

Pleurotus eryngii is a very important edible and medical mushroom，whose fermented filtrates contain a lot of secondary metabolites.The inhibition effect of the fermented filtrates from Pleurotus eryngii on the growth of Alternaria alternata，Fusarium oxysporum f.sp.cucmrium and Fusarium graminearum was investigated.The results showed that the fermented filtrates from Pleurotus eryngii showed the lysis phenomenon and it had significant inhibition effects on pathogen mycelial growth and spore germination.The inhibitory rate of the extracts against the mycelial growth showed as Fusarium oxysporum f.sp.cucmrium (92.78%)>Alternaria alternata (89.76%)>Fusarium graminearum (87.45%) and the inhibitory rate against the spore germination were Fusarium graminearum (79.45%)>Alternaria alternata (72.25%)>Fusarium oxysporum f.sp.cucmrium (52.32%).Therefore，there were the anti-pathogenic materials in fermented filtrates of Pleurotus eryngii，which could lay the foundation for the development of bio-inhibitor.

fermented filtrates of Pleurotus eryngii;plant pathogenic fungi;inhibition effect

浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):469-473http://www.zjnyxb.cn

侯潞丹，吴颖，张杰.杏鲍菇发酵液对3种植物病菌的抑制作用[J].浙江农业学报，2016，28(3)： 469-473.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.18

2015-08-18

山西师范大学科技开发基金项目(一般项目)(YK1201)

侯潞丹(1990—)，女，山西晋城人，硕士研究生，从事应用微生物的研发。E-mail∶347949871@qq.com

，张杰，E-mail∶604072014@qq.com

S476;Q939.96

A

1004-1524(2016)03-0469-05