兔出血症病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

王　波，李桂黎，王　印，姚学萍，杨泽晓

(四川农业大学　动物医学院，四川 成都　611130)



兔出血症病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

王波，李桂黎，王印，姚学萍，杨泽晓*

(四川农业大学动物医学院，四川 成都611130)

兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease，RHD)是一种具有高度传染性的疾病，严重威胁养兔业的健康发展。为了建立一种能够快速、高效、敏感的检测RHDV的方法，试验设计了一对特异性引物进行PCR扩增，得到RHDV VP60基因中979 bp的保守序列，并将其克隆到pMD19-T载体中作为标准品建立标准曲线；在扩增区域内设计一对简并引物，建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法，优化反应条件，并验证该方法的敏感性、特异性、重复性。结果表明：该方法可检测到的模板的最低拷贝数为8.18×101copies，只能特异性扩增RHDV，pGM19-T-EBHSV、兔巴氏杆菌、兔沙门氏菌、兔大肠埃希菌和健康兔组织RNA的扩增均为阴性，具有良好的特异性和重复性；同时用此方法对人工感染家兔的内脏分别进行检测，结果表明SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR能快速检测到不同脏器中的兔病毒性出血症病毒RNA含量，可用于临床兔瘟病毒的检测。

兔病毒性出血症病毒(RHD)；VP60；SYBR Green Ⅰ；实时荧光定量PCR

兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease，RHD)是一种急性的、具有高度传染性、高致死性的疾病[1]，又称兔瘟。它由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起，在自然条件下主要侵害青年兔和成年兔，2月龄以下的仔兔自然感染时一般不会发病死亡。兔瘟病毒感染兔群时发病率和死亡率高达90%～100%，已成为严重危害养兔业健康发展的一种疾病。1984年该病首先在我国江苏省暴发[2]，随后欧、亚、美、澳四大洲的一些国家均报道有本病流行[3]，随着世界各地关于兔瘟报道的增多，说明兔瘟现在已呈现出全球流行性[4-5]。世界动物卫生组织在1989年将兔瘟列为B类传染病，我国也将其列为二类传染病。

RHDV属于杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus)[6]，是没有囊膜的、单股正链RNA病毒[7]。目前被广泛用来检测的方法主要有：血凝试验、Western blot、酶联免疫吸附试验、免疫琼扩试验、RT-PCR等。这些方法的前期准备比较烦琐、耗时费力，而且试验敏感性低，SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR作为荧光定量PCR方法中的一种，当荧光染料嵌合于DNA双链结构的小沟部位后，会发射荧光信号，随着PCR反应的进行，SYBR Green Ⅰ不断与新合成的dsDNA结合，荧光强度随着聚合反应的进行逐渐增加，便可被荧光探测系统检测到[8]，荧光强度又与初始模板浓度量相关，既可定性检测也可定量检测。考虑到RHDV的变异，本研究根据GenBank中已公布RHDV VP60基因序列设计1对简并引物，对兔瘟病毒的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法进行了初步研究。

1　材料与方法

1.1主要试剂

荧光定量SYBR Green Ⅰ染料购买自生工生物工程(上海)股份有限公司；病毒基因组RNA提取试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购买自天根生化科技(北京)有限公司；反转录试剂盒购买自宝生物工程(大连)有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞由四川农业大学动物检疫实验室制备并保存。

1.2毒株

感染兔出血症病毒(RHDV)的病料、兔巴氏杆菌病菌种、兔沙门氏菌病菌种、兔大肠埃希菌菌种、健康兔组织由四川农业大学动物医学院实验室保存；欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)重组阳性质粒由四川农业大学动物医学院实验室王印[9]老师构建并保存。

1.3引物的设计与合成

在NCBI上下载已公布的RHDV VP60基因序列若干条，用DNAStar进行比对分析，利用Beacon Designer 8软件在其保守区设计一对特异性引物F1，F2，可扩增VP60基因的片段长度为979 bp，上游引物F1：5′-TCACTGGTGTTGGCAATG-3′，下游引物F2:5′-CAGACATAAGAAAAGCC-3′；在F1，F2引物的扩增区域内，设计1对SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR引物P1(5′-TGGAGATYGGTTTRAGTG-3′)，P2(5′-AATGAGTTCAGTCARGTCAA-3′)，可扩增的片段为165 bp。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.4病毒RNA的提取及反转录

根据病毒基因组RNA提取试剂盒说明书提取组织中病毒RNA，作为模板进行反转录，反转录体系为10.0 μL，其中5×PrimeScript Buffer 2.0 μL，RNase Free dH2O 2.0 μL，Ramdom 6 mers 2.0 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，RNA 3.0 μL。反转录程序为：37℃ 15 min，87℃ 5 s。得到cDNA，-20℃保存。

1.5VP60基因的PCR扩增和质粒的构建

用反转录得到的cDNA作模板进行PCR扩增，扩增的反应总体系为20.0 μL：其中2×Taq Master Mix 10.0 μL，cDNA 2.0 μL，F1、F2各1.0 μL(10 μmol·L-1)，加超纯水至20.0 μL。反应程序为：95℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸10 min。扩增后用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

将目的片段纯化回收，把回收的DNA连接到pMD19-T载体，再转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，构建重组质粒pMD-19T-VP60，经PCR鉴定后，将阳性质粒送北京擎科新业生物技术有限公司测序鉴定。将构建的质粒pMD-19T-VP60利用核酸蛋白仪测定其在260和280 nm处的吸光度，计算出DNA的浓度和纯度，之后将其进行10倍梯度稀释，作为阳性定量的标准模板，进行荧光定量PCR的扩增和建立标准曲线。

1.6实时荧光定量PCR的扩增及标准曲线的建立

将简并引物P1和P2进行PCR扩增，反应条件和反应程序同上，扩增后用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，验证引物是否合理。

用阳性质粒做模板进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增，将其反应条件和反应程序进行优化，确定其最佳反应条件和反应程序；将重组质粒进行10倍梯度稀释，作为荧光定量PCR扩增的模板，建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增的标准曲线。

1.7特异性试验

将实验室保存的欧洲野兔综合征病毒重组质粒、兔巴氏杆菌病菌种、兔沙门氏菌病菌种和兔大肠埃希菌菌种复苏，用菌液当模板，进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增。

1.8敏感性试验

将制备的阳性质粒标准品按10倍梯度稀释后，进行荧光定量PCR扩增，以此来测定荧光定量PCR所能检测出来的模板的最低拷贝数。

1.9重复性试验

用同一次提取的不同浓度的阳性质粒作为模板，在同一次试验中做3个重复，进行荧光定量PCR 扩增，测定标准品的稳定性，同时做阴性对照。

1.10初步应用

将含RHDV的病料组织研磨液经过过滤后，取1 mL对健康成年家兔(3只)进行腹腔注射，3 d后家兔死亡。分别取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏提取RNA，反转录为cDNA，用建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法进行检测，同时与普通RT-PCR[10]的检测结果进行比较。

2　结果与分析

2.1VP60基因的PCR扩增

从实验室保存的病料中提取RNA，将其反转录成cDNA后用F1，F2和P1，P2分别进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测后分别得到979 bp的目的片段(图1-A)和165 bp的目的片段(图1-B)，均无杂带，与预期的结果相符。

M： DL2000 Marker；1： 病料扩增产物;2： 靶基因扩增产物图1　RHDV VP60和靶基因PCR扩增Fig.1　PCR results of RHDV VP60 and target gene

2.2质粒的构建

将PCR扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶纯化回收，连接到pMD19-T载体，转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞，构建重组质粒pMD-19T-VP60，将其测序结果直接在NCBI上BLAST，得到的结果与RHDV VP60基因的同源性为96%。用核酸蛋白仪测定其浓度为32.9 mg·L-1，pMD-19T长度为2 692 bp，引物扩增长度为979 bp，DNA length=载体长度+引物扩增片段，即DNA length=(2692+979)bp=3671 bp，根据拷贝数计算公式：(6.02×1023)×质粒浓度(g·mL-1)/DNA length×660=copies·mL-1，得到重组质粒DNA拷贝数：(6.02×1023×32.9×10-6)μg·mL-1/(3671×660)=8.18×1012copies·μL-1。

2.3荧光定量PCR标准曲线的建立

将阳性质粒经10倍梯度稀释后选取8.18×107～8.18×1012拷贝数的样品作为模板进行荧光定量PCR扩增，通过对引物浓度的优化、退火温度的优化和各程序反应时间的优化，最终确定的最佳反应条件和反应程序为：在20.0 μL的反应体系中，2×SG Fast qPCR Master Mix 10.0 μL，P1和P2各加0.5 μL，DNF Buffer 2.0 μL，模板2.0 μL，灭菌超纯水5.0 μL；反应程序为：95℃ 3 min；95℃ 5 s，57℃ 10 s，72℃ 30 s，共40个循坏；生成动力学曲线(图2)和标准曲线(图3)。由图可见，NTC无特异性扩增，在所测定的范围内标准品与Ct值之间存在线性关系，线性回归方程Ct=-3.383×lgcopies+34.946(R2=0.997)。

2.4特异性试验

用建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应体系对RHDV阳性质粒、EBHSV阳性质粒、兔巴氏杆菌、兔沙门氏菌、兔大肠埃希菌和兔健康组织RNA进行荧光定量PCR检测，结果表明所设计的引物只能特异性的扩增RHDV，对EBHSV阳性质粒、兔巴氏杆菌、兔沙门氏菌等的检测结果均为阴性(图4)，说明所建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法具有很好的特异性。

1,8.18×1012 copies·mL-1;2,8.18×1011 copies·mL-1;3,8.18×1010 copies·mL-1;4,8.18×109 copies·mL-1;5,8.18×108 copies·mL-1;6,8.18×107 copies·mL-1;7,NTC(ddH2O)。图2　SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR动力学曲线Fig.2　The amplification of SYBR Green Ⅰ real-time PCR

图3　标准曲线Fig.3　The standard curve of SYBR Green Ⅰ real-time PCR

1:RHDV;2:pGM-T-EBHSV;3:兔巴氏杆菌;4： 兔沙门氏菌;5： 兔大肠埃希菌;6： 健康兔组织RNA;7:NTC(ddH2O)。图4　SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的特异性试验Fig.4　The specificity assay of SYBR Green Ⅰ real-time PCR

2.5敏感性试验

将制备的阳性质粒10倍梯度稀释后，作为模板进行荧光定量PCR扩增，得到的扩增曲线(图5)显示，在8.18×100copies时与阴性对照结果基本重合，说明其灵敏度为8.18×101copies。

2.6重复性试验

选取质粒浓度为8.18×1012～8.18×107copies·mL-1的样品模板按制备标准曲线的反应程序和反应条件进行荧光定量PCR扩增，所得到的样品Ct值在组内的变异系数分别为1.12%，0.34%，0.36%，0.23%，0.51%，0.29%(表1)，而Tm值一直维持相同的数值(81℃)，同时，从PCR扩增曲线(图6)可以看出每个样本的3条S曲线之间的误差都不到1个循环，说明此方法具有良好的重复性和准确性。

1,8.18×106 copies;2,8.18×105 copies;3,8.18×104 copies;4,8.18×103 copies;5,8.18×102 copies;6,8.18×101 copies;7,8.18×100 copies;8,NTC(ddH2O)。图5　SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的灵敏度试验Fig.5　The sensitivity assay of SYBR Green Ⅰ real-time PCR

表1SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR重复性试验

Table 1The reproducibility assay of SYBR Green Ⅰ real-time PCR

质粒浓度/(8.18×10n)Ct值(n=3)平均值标准差变异系数CV/%1012313.430.1511.121011317.620.0600.341010320.890.0770.36109324.440.0570.23108327.050.1480.51107330.910.0920.29

1,8.18×1012 copies·mL-1;2,8.18×1011 copies·mL-1;3,8.18×1010 copies·mL-1;4,8.18×109 copies·mL-1;5,8.18×108 copies·mL-1;6,8.18×107 copies·mL-1;7,NTC(ddH2O)。图6　SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的重复性试验Fig.6　The reproducibility assay of SYBR Green Ⅰ real-time PCR

2.7初步应用

用建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR法和普通RT-PCR法同时对实验室人工感染家兔的内脏分别进行检测，扩增完成后系统自动分析得到各脏器的Ct值(表2)，根据Ct值的大小与各脏器的含毒量相关性可知脏器中含毒量最多的是脾脏。普通RT-PCR方法的检测结果(图7)显示脾脏的条带最清晰，病毒含量最高，而心脏、肺脏的条带不明显，病毒含量相对较低，与SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测结果相符合，表明荧光定量PCR方法在RHDV的检测中不仅可以定量检测，而且具有更高的敏感性。

表2人工感染家兔内脏的Ct值

Table 2The Ct value of artificial infection rabbits

人工感染兔心脏肝脏脾脏肺脏肾脏A(Ct)28.0525.4018.6922.2235.45B(Ct)33.6121.2819.3531.2229.55C(Ct)23.8023.9021.8223.6126.40

M:DL2000 Marker；1： 心脏；2： 肝脏；3： 脾脏；4： 肺脏；5： 肾脏。图7　家兔内脏RHDV RT-PCR检测部分结果Fig.7　RT-PCR detection of rabbit organs

3　讨论

实时荧光定量PCR方法是20世纪90年代发展起来的一种新型核酸定量技术。目前，在临床医学和生命科学领域都得到了广泛的应用，已成为病毒含毒量检测的常用方法[11]，它解决了传统PCR方法在DNA序列扩增和之后的产物分析中量化困难的问题。SYBR Green Ⅰ染料法与荧光探针法相比，染料法不需设计、标记荧光探针，成本更低；另外，DNA在扩增和分析的过程都在同样的封闭系统完成，避免了样品和产物的污染，而且不需要进行PCR后续的实验处理或电泳检测，更加省时，操作更简便，可直接进行定性分析和定量分析，具有很好的实用性。

兔瘟自暴发以来，已给养兔业造成了严重的经济损失，亚洲、欧洲、澳洲对于兔瘟的报道也越来越多[12-13]，近年来虽有所控制，但仍有散发的报道。所以，建立一种快速、准确、省时的检测方法很有必要。考虑到RHDV存在基因突变，本试验通过在RHDV VP60序列的保守区设计简并引物，并优化引物浓度、退火温度及反应程序，成功建立了一种SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。简并引物具有相对较宽的检测范围，解决了因基因变异引起的难以扩增的问题，国内尚无使用简并引物检测RHDV的荧光RT-PCR研究的公开报道。2015年，Liu等[14]报道设计1对普通特异性引物建立了一种RHDV SYBR Green Ⅰ 荧光RT-PCR方法，并对临床样品和人工感染样品进行了检测，结果显示，受检样品中脾脏含毒量最多，这与本研究的检测结果一致。然而2007年张秀娥等[15]报道用建立的RHDV TaqMan MGB荧光RT-PCR检测方法，并对人工感染家兔内脏的病毒含量进行检测，结果显示，病毒在肝脏含量高于脾脏、血液、心脏、肺脏、肾脏和体液，这可能与病毒感染剂量或者感染途径有关。本研究采用一对带有简并碱基的引物通过反应条件优化、特异性试验、敏感性试验、标准曲线建立和人工感染样品的检测应用建立了RHDV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法，该方法能检测到的阳性质粒标准品的最低拷贝数为8.18×101copies，样品的组内变异系数为0.23%～1.12%，重复性和准确性高，与平行检测RT-PCR方法检测结果一致，且具有比普通RT-PCR更高的敏感性。因此，本试验建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法在定性、定量方面均具有良好的实用性，不仅可用于不同地方不同RHDV毒株的实验室快速检测诊断，也可用于RHDV不同组织中定量检测和致病机制的相关研究中。

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(责任编辑卢福庄)

Establishment and application of SYBR Green Ⅰ real-time PCR for detection of rabbit hemorrhagic disease virus

WANG Bo，LI Gui-li，WANG Yin，YAO Xue-ping，YANG Ze-xiao*

(College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China )

Rabbit hemorrhagic disease is a highly contagious disease which causes serious damage to the healthy development of rabbit keeping.In order to establish a quick，efficient and sensitive detection method，a pair of specific primers were designed for PCR amplification to obtain 979 bp sequence of rabbit hemorrhagic disease virus(RHDV) VP60 gene.Then cloned it into pMD19-T vector to construct recombinant plasmid named pMD-19T-VP60，which was served as template to establish the standard curve.Meanwhile，a pair of degenerate primer was designed in the amplification region to establish the SYBR Green Ⅰ real-time PCR detection method，and the reaction condition was optimized，and the sensitivity，specificity and reproducibility were tested.The results showed that the SYBR Green Ⅰ real-time PCR could specifically detect RHDV that the limited detection content was 8.18×101copies and no amplification of pGM19-T-EBHSV，Pasteurella multocida，Salmonella，Escherichina coli and healthy organs from rabbits.At the same time，this method was used to detect the internal organs of artificial infection rabbits.The results showed that the SYBR Green Ⅰ fluorescence quantitative PCR could quickly detect the content of the virus RNA in different organs.So this assay could be applied in clinical diagnosis of RHDV.

rabbit hemorrhagic disease virus(RHDV);VP60;SYBR Green Ⅰ;real-time quantitative PCR

浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis，2016，28(3):400-405http://www.zjnyxb.cn

王波，李桂黎，王印，等.兔出血症病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[J].浙江农业学报，2016，28(3):400-405.

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.03.07

2015-11-04

国家自然科学基金资助项目(3140222)；四川省教育厅青年基金资助项目(11ZB064)

王波(1990—)，女，四川邛崃人，硕士研究生，研究方向为预防兽医学。E-mail：18728156822@163.com

，杨泽晓，E-mail：yzxyang2003@126.com

S852.65+9.6

A

1004-1524(2016)03-0400-06