坏死性凋亡特异性抑制剂抗环孢素A致坏死性凋亡的机制研究＊

欧阳资章，刘晓萍，陈　方，肖诚胤，赖香茂，钟志华，阮　劲，邓惠容，江　晟，王秋玲

(广州医科大学附属第六医院·清远市人民医院，广东清远511518)

坏死性凋亡特异性抑制剂抗环孢素A致坏死性凋亡的机制研究＊

欧阳资章，刘晓萍，陈方，肖诚胤，赖香茂，钟志华，阮劲，邓惠容，江晟，王秋玲

(广州医科大学附属第六医院·清远市人民医院，广东清远511518)

目的研究坏死性凋亡特异性抑制剂（Nec-1）抗环孢素A致坏死性凋亡的机制。方法将30只C57/BL6雄性小鼠随机分为对照组、环孢素A组、Nec-1组，对照组给予橄榄油口服，环孢素A组以100 mg/(kg·d)灌胃给予环孢素A，Nec-1组在给予环孢素A前0.5 h采取腹腔注射方式给予Nec-1 2.5 mg/kg。14 d后测定小鼠血液肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)含量变化，皮质中还原型谷胱甘肽(GSH)活性变化，丙二醛(MDA)含量变化;检测皮质中受体连接蛋白(RIP3)表达。结果处理后14 d，与对照组比较，环孢素A组能使血清中SCr及BUN水平明显升高，皮质中GSH活性下降，丙二醛(MDA)水平升高;与环孢素A组比较，Nec-1组SCr及BUN水平明显下降，GSH活性增加，丙二醛含量下降(P＜0.05)，但3组小鼠皮质中RIP3表达无明显差异。结论Nec-1对环孢素A肾毒性具有保护作用，表明环孢素A肾毒性可能与坏死性凋亡有关。

环孢素A;坏死性凋亡特异性抑制剂;坏死性凋亡

环孢素A为传统的免疫抑制药物，用于肾抑制等，但其具有较明显的肾毒性，影响了临床应用。关于环孢素A肾毒性的研究及其机制的研究已有许多，但引起肾毒性的机制目前仍未完全清楚［1-5］。近年来，研究人员发现了一种新的细胞死亡方式，即能被坏死性凋亡特异性抑制剂（Nec-1）特异性抑制的坏死性凋亡［6-10］。环孢素A的肾毒性机制是否涉及坏死性凋亡，目前研究甚少。笔者曾采用大鼠肾小管上皮细胞NRK52E细胞，研究了环孢素A的肾毒性机制，研究结果显示坏死性凋亡可能是环孢素A肾毒性的机制之一［11］。本研究中，笔者制作了小鼠环孢素A急性肾损伤模型，研究Nec-1是否对环孢素A的肾毒性有保护作用。现报道如下。

1　材料与方法

1.1药品、动物与分组

环孢素软胶囊(商品名新赛斯平，杭州中美华东制药有限公司，国药准字H10960121，批号为140232，规格为每粒10 mg)，Nec-1(SIGMA公司，批号为MB5067);橄榄油为食用级别。

30只C57/BL6雄性小鼠购于广东医学实验动物中心，动物注册号为SCXK（粤）2013-0002;鼠龄(7.2±1.4)周;体重(20.7±2.5)g。各组试验动物自由采食，常规商品饲料，自由饮水，每日12 h光照。将其随机分为对照组、环孢素A组、Nec-1组，各10只。

1.2给药方法

对照组给予橄榄油口服，环孢素A组以100 mg/(kg·d)灌胃给予环孢素A，Nec-1组在给予环孢素A前0.5 h采取腹腔注射方式给予Nec-1 2.5 mg/kg。

1.3观察指标

小鼠经处理后14 d，采集其静脉血以全自动生化分析仪器测定血液肌酐(SCr)、尿素氮（BUN）含量变化;分离大鼠肾皮质，剪碎，匀浆，取上清液，采用试剂盒测定小鼠肾皮质中还原型谷胱甘肽(GSH)活性及丙二醛(MDA)含量。提取小鼠肾皮质中蛋白质，采用Western Blotting检测RIP3表达。

1.4统计学处理

2　结果

2.1小鼠ScR，BUN，GSH，MAD含量

结果见表1。处理前，对照组与环孢素A组、Nec-1组在ScR，BUN，GSH，MDA水平等方面差异不显著(P＞0.05);处理后14 d，Nec-1组的SCr，BUN，GSH，MDA各项指标水平与对照组差异不显著(P＞0.05)，但环孢素A组SCr，BUN，MDA水平均显著高于其他2组，而GSH水平显著低于其他2组(P＜0.05)。

2.2小鼠全肾、皮质、髓质中RIP3表达情况

3组小鼠各部位中RIP3表达检测结果见图1。Wwestern Blotting结果显示，3组RIP3表达无明显差异(P＞0.05)。

表1　3组小鼠ScR，BUN，GSH，MDA水平变化水平比较(X±s，n=10)

图1　3组小鼠皮质部RIP3表达情况

3　讨论

环孢素A目前仍是器官移植抗免疫排斥反应主要药物，然而其可导致肾小球滤过率降低、肾小管上皮细胞坏死、肾间质纤维化等不良反应，限制了其临床应用［12-16］。目前有关环孢素A肾毒性的机制研究甚多，包括氧自由基损伤，血管的因子如血管内皮素、血烷酸素分泌过多，肾素-血管紧张素系统的激活，局部交感神经的激活等［17］。目前认为，环孢素A毒性分子机制集中在以下几个方面［18］:环孢素A对肾小管上皮细胞有直接毒性，能启动细胞内、外凋亡途径使肾小管上皮细胞凋亡或者坏死、甚至老化;环孢素A诱导内质网应激;环孢素A可直接刺激肾小管上皮细胞产生活性氧自由基(ROS)。

细胞死亡方式包括凋亡与坏死，认为凋亡属于一种程序性的死亡方式，可被调控;而在相当长的一段时间内，认为细胞坏死并不能被调控，坏死只是一种被动的、偶然性的、无规律的死亡过程。随着研究的深入，发现一些不依赖于细胞色素释放及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶活性的细胞死亡途径同样受到细胞内许多信号通路的影响和精确调节。2005年，哈佛大学医学院的袁钧英首次报道了的一种由精确的细胞信号通路引起的坏死，即程序性坏死（necroptosis）。Necroptosis概念的提出颠覆了所有细胞坏死是被动、偶然、不能被调控的旧观点。与传统意义上坏死不同，其是一种由死亡受体通路介导的细胞死亡途径，是主动的、程序性的细胞死亡，其涉及的信号蛋白包括RIP1与RIP3。它在形态学和功能上与凋亡也不同，在损伤早期就有胞膜完整性的损失和线粒体膜电位的下降。袁钧英同时还从2万个化合物中筛选了一种抑制坏死性凋亡的化学小分子，即Nec-1，其可作为坏死性凋亡的特异性抑制剂，凡是能被Nec-1抑制的细胞死亡方式被认为是坏死性凋亡。坏死性凋亡可能是某些药物导致组织、器官毒性的重要机制，甚至可能是某些疾病发生的重要机制。已经有研究尝试将Nec-1用来预防、治疗毒性物质的毒性等［19］。

笔者在既往研究中曾运用NRK52E细胞模型研究表明坏死性凋亡参与了环孢素A的细胞毒性［11］，但目前尚无实验动物方面的研究，故本研究采用小鼠探讨环孢素A的肾毒性机制是否与坏死性凋亡有关。

本研究中，环孢素A组小鼠在处理14 d后，血液肌酐与尿素氮水平显著提高，但Nec-1组无显著变化，说明Nec-1能显著抑制环孢素A对小鼠肾脏的毒性作用，防止肾小管上皮细胞凋亡或死亡的发生。环孢素A组小鼠处理14 d后，还原性谷胱甘肽显著降低、丙二醛水平显著上升，表明环孢素A处理后，小鼠体内氧化程度加剧，但Nec-1组小鼠还原性谷胱甘肽与丙二醛水平与对照组无显著差异，且显著低于环孢素A组，说明Nec-1能有效降低环孢素A引起肾毒性。但遗憾的是，笔者并未测得RIP3蛋白表达的变化，环孢素A肾毒性坏死性凋亡的机制是否只影响RIP3的上游蛋白RIP1或只影响RIP3活性的变化，仍需要进一步研究。

综上所述，坏死性凋亡参与了环孢素A的肾毒性，但目前尚无证据表明环孢素A可诱导RIP3的表达。

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Mechanism of Necrostatin-1 on Necroptosis Induced by Cyclosporin A

Ouyang Zizhang，Liu Xiaoping，Chen Fang，Xiao Chenyin，Lai Xiangmao，Zhong Zhihua，Ruan Jin，Deng Huirong，Jiang Sheng，Wang Qiuling
（The Sixth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University·Qingyuan People's Hospital，Qingyuan，Guangdong，China511518）

ObjectiveTo explore the protective effect mechanism of necrostatin-1（Nec-1），a specific inhibitor of necroptosis，on nephrotoxicity of cyclosporin A（CsA）in vivo.Methods30 C57/BL6 male mice were randomly divided into the control group，CsA group and Nec-1 group.The control group was treated with olive oil.The CsA group was treated with CsA 100 mg/kg·d by gavage.The Nec-1 group was treated with Nec-1 2.5 mg/kg 0.5 h before treated with CsA.After 14 d of treatment，the content change of SCr，BUN were determined，the activity change of GSH and content change of MDA in the cortex were determined.The expressions of RIP3 in the cortex were detected.ResultsAfter 14 d of treatment，compared with the control group，the levels of SCr，BUN were increased，the activity of GSH in the cortex deceased，and MDA level increased in the CsA group；the levels of SCr，BUN were obviously decreased，the activity of GSH increased，and MDA level decreased in the Nec-1 group；however，the expression of RIP3 in the cortex of the 3 groups showed no significant difference.ConclusionNec-1 has obvious protective effect on nephrotoxicity induced by CsA.Necroptosis underlies mechanism of the toxicity of CsA.

cyclosporin A；necrostatin-1；necroptosis

R965;R979.5

A

1006-4931（2016）13-0010-03

2016-02-22;

2016-03-24）

＊广东省医学科学技术研究基金，项目编号:A201484016060888。