某地区儿童血液感染嗜麦芽窄食单胞菌的耐药基因分布研究

罗卉丽，张文虹

(十堰市妇女儿童医院,湖北 十堰　442000)



◇临床医学◇

某地区儿童血液感染嗜麦芽窄食单胞菌的耐药基因分布研究

罗卉丽，张文虹

(十堰市妇女儿童医院,湖北 十堰442000)

目的了解本地区儿童血液感染嗜麦芽窄食单胞菌(SMA)耐药基因分布。方法收集SMA阳性菌株，纸片法进行药敏试验、ESBLs、AmpC、KPC、MBLS等耐药表型；PCR法检测耐药基因、正反向测序。结果检测出耐药相关基因片段blaTEM、blaSHV、blaCARB、blaIMP、bla OXA-10、oprD2、 aac(6’)-I、ant(2″)-I、ant(3″)-I 、aac(6’)-II、gyrB的阳性率分别为22.8%(8/35)、11.4%(4/35)、17.1%(6/35)、94.3%(33/35)、8.6%(3/35)、28.5%(10/35)、68.6%(24/35)、48.6%(17/35)、17.1%(6/35)、8.6%(3/35)、17.1%(6/35)。结论本地区SMA耐药情况非常严重，应加强重视。

嗜麦芽窄食单胞菌;抗药性,细菌;多药耐药相关蛋白质类;儿童

嗜麦芽窄食单胞菌感染率近几年呈不断上升趋势，作为非发酵菌中检出率位列第三的菌种，它已越来越多的在医院院感(医务人员手、物表、水龙头)中被检测出，对免疫力低下的儿童、重症监护病房的患者、长期住院的慢性病人等威胁越来越大，该菌现已成为医院感染的重要致病菌[1]。由于该菌多重高度的耐药性，给临床医师的治疗带来严峻的挑战，因此对该菌耐药基因分布的研究分析具有重要的意义[2]。

1　材料与方法

1.1标本来源地区三家三级医院2014年度医院儿科病人血液标本中分离出的多重耐药嗜麦芽窄食单胞菌共35株，对所选取的35个患儿，经医院伦理委员会批准，均告知家长使其对本研究知情同意并签字。

1.2仪器与试剂全自动细菌鉴定系统；DNA扩增仪；全自动基因测序仪；PCR Master MIX；抗菌药物纸片等。

1.3引物[3-8]见表1。

1.4方法纸片扩散法检测细菌药敏试验、耐药表型；PCR法检测相关基因；电泳法筛选阳性产物；基因测序法进行序列分析。

2　结果

2.1耐药性结果该菌耐药情况严重，对美罗培南、亚胺培南天然耐药达100%，对头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南、哌拉西林、庆大霉素、阿米卡星等均耐药严重，仅对复方新诺明、左氧氟沙星耐药性稍低，对该菌耐药基因分布研究对指导临床合理用药，避免耐药性的日趋严重迫在眉睫，具体耐药性结果见表2。

表1　引物

表2　多重耐药嗜麦芽窄食单胞菌的耐药率(n=35)

2.2耐药表型结果通过经典表型检测方法测得结果如下：KPC表型未检出;ESBLs表型阳性率45.7%；AmpC表型阳性率14.3%；MBLs表型阳性率94.3%。

2.3耐药基因检测结果见图1～11。

耐药基因片段blaTEM、blaSHV、blaCARB、blaIMP、blaOXA-10、oprD2、aac(6’)-I、ant(2″)-I、ant(3″)-I、aac(6’)-II、gyrB阳性率分别为22.8%、11.4%、17.1%、94.3%、8.6%、28.5%、68.6%、48.6%、17.1%、8.6%、17.1%。未检出blaKPC、blaPER、blaVEB、blaGES、blaVIM、blaSPM、blaGIM、blaDHA、blaOXA-1、blaOXA-2、gyrA基因片段阳性菌株。

图1　blaTEM基因电泳图

图2　blaSHV基因电泳图

图3　blaCARB基因电泳图

图4　blaIMP基因电泳图

图5　bla OXA-10基因电泳图

图6　oprD2基因电泳图

图7　aac(6’)-I基因电泳图

图8　ant(2″)-I基因电泳图

图10　aac(6’)-II基因电泳图

图11　gyrB基因电泳图

2.4基因序列与GenBank进行同源性分析见图12-19：在Pubmed网站GeneBank上进行结果比对分析：blaTEM、blaCARB、blaOXA-10、oprD2、aac(6’)-I、ant(2″)-I、aac(6’)-II、gyrB基因分别是:AB282997的TEM-1亚型基因、HQ157204的CARB-2亚型基因、GU367339的OXA-10亚型基因、GQ324957的基因、HQ018641的aacA4亚型基因、HQ880271的基因、HQ880255基因、CP006985基因序列相同(基因测序结果见图12～19)。blaSHV、blaIMP、ant(3″)-I基因与GenBank注册的基因同源性均低与90%。

图12　TEM基因部分测序图

图13　CARB基因部分测序图

图14　OXA-10基因部分测序图

图15　oprD2基因部分测序图

图16　aac(6’)-I基因部分测序图

图17　ant(2″)-I基因部分测序图

图18　aac(6’)-II基因部分测序图

图19　gyrB基因部分测序图

3　讨论

ESBL能水解氧亚胺基β-内酰胺抗菌药物，可被β-内酰胺酶抑制剂所抑制的一类酶[9]。自20世纪80年代首次分离出质粒介导的AmpC酶以来,新的AmpC酶在世界各地被陆续报道[10-11]。细菌对此类抗生素产生耐药性一是产生钝化酶(AMEs)修饰抗生素使之失活，二是抗生素的作用靶位核糖体或与核糖体结合的核蛋白的氨基酸突变使抗生素不能结合或结合力下降。细菌对喹诺酮类药物产生耐药主要是由于靶酶的突变以及非特异性的药物外排机制导致[12-13]。编码靶酶的基因gyrA和gyrB的核苷酸序列以及靶酶的序列很相似[14]。试验结果表明：ESBLs表型阳性为45,7%，基因阳性分别为blaTEM(22.8%)和blaSHV(11.4%),基本符合，检出blaOXA-10阳性率为8.6%,未检出blaOXA-1、blaOXA-2，说明在本地区携带OXA-10可能导致细菌产ESBLs，它由可移动的遗传因子基因编码，这可能是它们在细菌的广泛传播的原因之一；AmpC酶引起的耐药在本地区是由blaDHA基因编码的质粒介导；对碳青霉烯类耐药可以从外膜膜孔蛋白OprD表达减少或丢失、产金属酶等耐药机制的存在得以解释[15]，本研究中MDRSMA对β-内酰胺类抗菌药物耐药与携带bla TEM、blaSHV、blaOXA-10、blaCARB、blaIMP等基因以及膜孔蛋白基因oprD2缺失有关。基因序列分析分别为TEM-1、OXA-10、CARB-2亚型；多重耐药嗜麦芽窄食单胞菌均能检出一种或一种以上氨基糖苷类修饰酶基因(AMEs)[16]，虽然有许多其他的AMEs报道，但是在嗜麦芽窄食单胞菌中最常见的AMEs是aac(6')-I和ant(2″)-I，前者可对庆大霉素，卡那霉素和新霉素耐药，后者对庆大霉素和妥布霉素耐药；对喹诺酮类抗生素的耐药达30%，可能与携带耐药基因gyrB有关，还是否与非特异耐药机制主动外排有关有待进一步考证。总之，实验室应加强细菌耐药性监测，指导临床合理使用抗菌药物，医院应加强医院感染控制工作，防止细菌耐药性产生，有效控制耐药菌株的播散和流行。

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Drug resistance and its gene distribution on children's blood infection with Stenotrophomonas maltophilia

LUO Huili,ZHANG Wenhong

(ShiyanMaternalandChildHealthcareHospital,Shiyan,Hubei442000,China)

ObjectiveTo study the positive strains of children’s blood infection of Stenotrophomonas maltophilia,and to investigate the local prevalence of Stenotrophomonas maltophilia so as to guide the appropriate use of antibiotics.MethodsWe tested the sensitivity of the commonly ESBLs,AmpC,KPC,and MBLs with disk diffusion,detected the drug resistance genes with polymerase chain reaction(PCR),and analyzed positive results with forward and reverse sequencing.Cluster analysis was done on 23 kinds of resistance genes with molecular marker genotyping method.ResultsThe positive rates of blaTEM,blaSHV,blaCARB,blaIMP,bla OXA-10,oprD2,aac(6’)-I,ant(2″)-I,ant(3″)-I,aac(6’)-II,gyrB were 22.8%(8/35),11.4%(4/35),17.1%(6/35),94.3%(33/35),8.6%(3/35),28.5%(10/35),68.6%(24/35),48.6%(17/35),17.1%(6/35),8.6%(3/35) and 17.1%(6/35),respectively.ConclusionsThe drug resistance to SMA in this area is very serious and there is the possibility of nosocomial transmission,which should be paid more attention to.

Stenotrophomonas maltophilia;Drug resistance,bacterial;Multidrug resistance-associated proteins;Child

湖北省卫计委科研基金资助项目(WJ2015Z115)；湖北省十堰市科技局科技项目(15K71)

张文虹，女，副主任技师，研究方向：临床检验，E-mail:2671815504@qq.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.014

2016-03-21，

2016-07-07)