马齿苋合剂治疗实验性皮肤缺失性创伤的效果观察

杨春华，贺鹏亮，李瑞航，宁鹏，于永忠

(黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江 大庆　163319)



马齿苋合剂治疗实验性皮肤缺失性创伤的效果观察

杨春华，贺鹏亮，李瑞航，宁鹏，于永忠

(黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江 大庆163319)

目的考查马齿苋合剂治疗模式动物皮肤缺失性创伤的效果。方法采收培育的荷兰马齿苋鲜草，经粗磨过滤方法制备马齿苋有效成分混合制剂，配以细叶杜香、波斯菊、蜂蜜等中药成分，配以相应的赋形剂，制成外用中药合剂。选取纯白家兔20只和Balb/c小鼠30只，分别随机分组，设马齿苋合剂组、云南白药(阳性对照)组和丁二醇阴性对照组，于背部以外科手术法制造皮肤缺损性创口，施药(施药剂量：家兔20 mg/只、小鼠10 mg/只)，每天观测治疗效果。结果马齿苋合剂组与云南白药组相比，创伤创缘的向心性聚缩速度平均慢1～2 d，肉芽组织形成及上皮再生情况差异无统计学意义(P>0.05)，但明显优于阴性对照组(P<0.05)。结论马齿苋合剂能明显促进实验动物皮肤缺损性创伤的愈合。

马齿苋;云南白药;投药,皮肤;软组织损伤;兔;小鼠,近交Balb/c

马齿苋(PortulacaoleraceaL.)是我国传统中药之一，具有较高的营养价值，也可以药食两用。《本草纲目》中记载，马齿苋具有“散血消肿，利肠滑胎，解毒通淋，治产后虚汗”等功效[1-2]。经现代技术检测分析，马齿苋全草含有去甲肾上腺素、生物碱、香豆素、维生素A、维生素E、黄酮类强心苷及蒽醌类等生物活性成分，其中，黄酮类物质是一种天然的抗氧化剂，不仅能有效预防心血管疾病，还能调节免疫、抑菌消炎，已被列为保健食品的一类功能因子[3]。此外，马齿苋中的维生素A样物质，能维护上皮细胞正常的生理功能，并能促进组织溃疡的愈合[4]。民间验方中，马齿苋可用于清热解毒、凉血消肿，通常外用于治疗多种皮肤病，如湿疹、烫伤、丹毒、肿疡、皲裂、扁平疣、带状疱疹和黄褐斑等[5-9]。培养的荷兰马齿苋在产量、品质等方面均优于野生品种，但在有效成分含量及功效方面，尚没有比较性数据报道。另依据《中国药典》记录，野生波斯菊具有清热解毒作用，外用可以治疗痈疮肿毒；杜香外用具有镇痛作用，还可以作为促渗剂使用[10]；蜂蜜具有止痛、解毒、抑菌和营养细胞等作用。

本研究利用荷兰马齿苋、波斯菊、杜香的萃取液和天然蜂蜜混合，佐以赋形剂，制成马齿苋合剂，通过处理实验动物皮肤局部缺失性手术创面，考查创缘的向心性聚缩速度、肉芽组织形成及上皮再生情况，评价其在促进皮肤创伤愈合方面的治疗效果。

1　材料与方法

1.1材料荷兰马齿苋鲜草采收于马齿苋种植基地；细叶杜香鲜叶由黑龙江大兴安岭地区阿木尔林业局林场提供；波斯菊花蕾属本地种植品种；纯天然蜂蜜购置于本地医药商场。云南白药(批号ZCA1411)、速眠新Ⅱ(批号080405)、 1%碘伏(批号140706)、脱毛剂购于本地医药超市；苏木素伊红(HE)染色试剂盒(产品编号：AR1180)购于博士德生物公司；丁二醇为分析纯级；0.7%生理盐水、Bouin’s溶液及铬矾明胶溶液等由实验室配制。

1.2主要仪器主要仪器包括：榨汁机(JYZ- d526)；超声细胞破碎仪(SONICS) ；湘仪台式大容量冷冻离心机(T dL-5M) ；电热恒温水浴锅(hWS12)；高压蒸汽灭菌锅(SANYO MLS-3780)；数码相机(SONY dSC-TX100)；以及4 ℃冰箱、电热鼓风干燥箱(101-2AB)、轮转式切片机(K d-202)、生物组织摊片机(K d-P)、生物组织烘片机(K d- h)、Leica dMI 4000显微镜(dMI 4000 B)、外科手术器械及一次性注射器等。

1.3马齿苋合剂的制备取马齿苋鲜草，用自来水冲洗去除泥沙，再用蒸馏水浸泡洗涤3次，每次5 min；取出放置于消毒过的手术隔离单上晾干；榨汁机用75%酒精消毒后，用蒸馏水反复冲洗3次；将晾干的马齿苋放于榨汁机内榨取，滤过残渣，滤液用超声细胞破碎仪进行超声破碎15 min后，加入丁二醇浸提过夜，用离心机3 000 r·min-1离心15 min，合并萃取液，获得马齿苋萃取液，置于消毒处理的玻璃瓶内，4 ℃冰箱保存备用。再取波斯菊花蕾、杜香叶，洗净烘干粉碎，粗提萃取有效成分后，合并马齿苋萃取液再与蜂蜜混合，通过巴氏灭菌处理[11-12]制成马齿苋合剂。本研究初步制备的马齿苋合剂主要成分包含马齿苋80%(v/v)，波斯菊、杜香、蜂蜜各5%以及适量赋形剂。

1.4实验动物分组选取SPF级纯白色雌性家兔20只，由长春生物制品研究所有限公司提供(合格证号：scXK(吉)2011-0007)，平均体重2.5 kg，随机分成组Ⅰ、组Ⅱ两组。组Ⅰ用于记录马齿苋(M)和云南白药(N)；组Ⅱ用于记录马齿苋(M)和丁二醇(K)。选取SPF级BALB/c小鼠30只，由吉林大学实验动物中心提供，平均体重0.025 kg，随机分成3组即组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ，每组各10只。组Ⅰ记录马齿苋(M)；组Ⅱ记录云南白药(N)；组Ⅲ记录丁二醇(K)。所有实验动物营养状况良好，并在同等条件进行饲养管理及实验处理。

1.5实验动物处理首先对实验动物进行药物脱毛处理，处理后自然脱敏1～2 d，然后进行创伤模型建立。家兔组采用速眠新Ⅱ(0.1～0.2 mL·kg-1)实施全麻。术面选在家兔背部脊柱中线左右两侧，距离约2.0 cm处。局部术面大范围以1%碘伏及 75%酒精常规消毒，用手术刀分别作边长(2.5±0.2) cm正方形的皮肤全层切除创面，顺向创缘平行于中线。对伤口采用无菌纱布压迫止血10 min，暴露创面24 h，期间给予常规饮食。小鼠采用速眠新Ⅱ(0.3～0.8 mL·kg-1)实施全麻，局部术面大范围以1%碘伏及75%酒精常规消毒。在背部中间作边长(1±0.2)cm正方形的皮肤全层切除创面，对伤口采用无菌纱布压迫止血10 min，暴露创面24 h，给予常规饮食。实验动物创伤暴露24 h后，用生理盐水冲洗创面2次，按表1方法敷药治疗，每天换药一次，连续1周。

表1　实验动物分组及治疗方法

注：M：马齿苋合剂组；N：云南白药组;K：丁二醇组；L:家兔背部左侧；R：家兔背部右侧。

1.6组织标本病理切片的制备采用 HE染色组织切片技术制备小鼠皮肤创伤组织标本病理切片。在切创12 d 后从小鼠组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ中各取5只小鼠断颈处死，取小鼠皮肤组织标本1.0 cm×1.0 cm生理盐水漂洗后放入标记好的固定瓶中，Bouin’s固定72 h，70%乙醇冲洗2 min然后将组织块切割成0.5 cm×0.4 cm大小，分别放入80%乙醇、90%乙醇中各脱水3 h，95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ中各脱水2 h，无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ各脱水2 h；再放入1/2无水乙醇+1/2二甲苯中过夜，次日再放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各2 h组织透明，接着放入已融化的石蜡中包埋,经过3次蜡杯逐渐浸蜡,将凝固的含有组织块的蜡块修成适宜的大小和形状,放在切片机上固定好,切成6 μm 厚切片，把切好的组织标本轻轻放入生物组织摊片机中展开后，贴在载玻片的一侧，在另一侧做好标记，放入生物组织烘片机烘干。

HE染色:将切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ，每级 10 min，逐渐脱去石蜡；分别放入1/2无水乙醇+1/2二甲苯、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中，每级5 min，逐渐脱苯；蒸馏水冲洗2 min；滴加苏木素覆盖标本，染色3～5 min，蒸馏水轻轻冲洗2 min；将切片浸入返蓝液中30 s，蒸馏水轻轻冲洗2 min；将切片浸入95%乙醇中30 s，直接滴加伊红染色30 s，蒸馏水轻轻冲洗2 min；70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、1/2无水乙醇+1/2二甲苯、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ，每级1 min，组织脱水透明；染色后的切片从二甲苯中取出后，滴中性树胶封固，放在通风处晾干，光镜下观察结构变化，Leica dMI 4000显微镜下摄片。

1.7统计学方法为考查不同类型的药物(制剂)对实验动物创伤创缘的向心性聚缩速度的影响，记录创面面积的数值，所有数据通过Origin 85软件进行处理。

2　结果

2.1家兔创伤实验结果观察家兔实验结果如图1所示。家兔组Ⅰ和组Ⅱ在药物连续处理3天时，局部差异无统计学意义。第4天,组Ⅰ创口明显收缩，创面减小，且创缘肿胀程度减轻；丁二醇组创口收缩较实验组差，创缘肿胀程度仍较明显。组Ⅰ第10～12天可见结痂已逐渐脱落，伤口已被新生上皮组织覆盖，15 d可见伤口愈合良好，体被新毛，无感染、化脓和肿胀等其他反应；丁二醇组第10～12天结痂并未脱落，18 d伤口愈合良好。

注：A:家兔创伤药物处理10 d后愈合情况.B，C:马齿苋组和云南白药组治疗3 d和10 d结果比较(红箭头代表云南白药组；蓝箭头代表马齿苋实验组).D、E:马齿苋组和丁二醇组治疗3 d和10 d结果比较(红箭头代表丁二醇组；蓝箭头代表马齿苋实验组)。

2.2小鼠创伤实验结果观察BALB/c小鼠实验结果如图2所示。用药后第2天，观察三组实验老鼠，创面局部情况无明显差异。第5天，小鼠组Ⅰ和组Ⅱ伤口边缘明显收缩，组Ⅲ无明显变化；第7天，组Ⅰ和组Ⅱ痂皮干燥、粗糙，四周边缘上翘更明显，对照组痂皮无明显上翘；组Ⅰ第10～12 d可见结痂已逐渐脱落，伤口已被肉芽组织覆盖；第19天三组实验小鼠创面已基本痊愈，伤口愈合良好，体被新毛，如图2所示。在第2天，第7天和第12天记录小鼠创面面积作图3，第12天时组Ⅰ和组Ⅱ的创面大小明显小于组Ⅲ，第19天时基本痊愈。

注：M：马齿苋合剂组小鼠，N：云南白药组小鼠，K：丁二醇组。

注：小鼠实验组和对照组创伤恢复情况(横坐标：小鼠创伤恢复天数(d)；纵坐标：创伤面积大小cm2)。第2天，组Ⅰ与组Ⅲ差异有统计学意义(P<0.05)；第7天，组Ⅱ与组Ⅲ差异有统计学意义(P<0.05)；第12天，组Ⅰ、组Ⅱ分别与组Ⅲ差异有统计学意义(P<0.01)；第19天，组Ⅰ、组Ⅱ分别与组Ⅲ差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3创面样本组织病理切片结果创伤愈合12 d后,与用药前正常小鼠皮肤相比较， HE 染色时实验小鼠愈合皮肤厚度基本正常,表皮组织结构完整,细胞分层清晰；与空白对照组相比较，云南白药组、马齿苋合剂组的小鼠愈合皮肤有较多皮肤附属器，愈合界线比较明显；对照组创面愈合时有血管形成，瘢痕较少；云南白药组、马齿苋合剂组有血管形成及少许炎性细胞浸润,瘢痕较多。见图4。

注：A、F(a)：云南白药组，B、F(b),C、F(c)：马齿苋合剂组，D、F(d)：丁二醇组，E：正常皮肤。

3　讨论

本研究利用培育的荷兰马齿苋为主要原料配制合剂，针对实验动物进行创伤愈合的效果验证，结果显示，马齿苋合剂能明显促进实验动物皮肤缺损性创伤的愈合，有较好的促进上皮组织修复的功效。

临床中，局部皮肤切除或深度烧伤等创伤修复所需时间较长、物质较多，因此，可以从宏观水平观察伤口愈合效果，还可以从微观水平研究伤口愈合过程[13]。在细胞水平上，创面愈合依赖于表皮细胞等的再生，该过程由来自创缘和创面皮肤附件的表皮细胞通过创面表面的增殖和迁移来完成，创面修复还需要角质细胞、毛囊表皮细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞的大量增殖，所以可以用相关的细胞增殖情况来反应创伤愈合进展。为便于临床观察与处理，普遍认为创面愈合时间和组织病理学分析仍是直接而有效的创面愈合评价指标，而伤口局部的巨噬细胞数量则标志炎症阶段即将结束，增生阶段即将来临[14-16]。

本实验中，所有实验动物切创处理后自然脱敏1～2 d，目的是在自然条件下，结合机体的自愈功能，给予相应的治疗，从而全面客观地评价药物作用及影响。在此期间所有实验动物均未发生皮肤创口水肿、感染、化脓及坏死等病理变化，并且创口愈合以及毛发的再生较快。家兔皮肤切创愈合过程中的肉芽组织覆盖创面并且再上皮化覆盖肉芽组织的时间约为 10～12 d，从切创到完全愈合所用时间约为18 d，时间跨度的原因分析可能为家兔活动度不同导致伤口宽窄不一(再上皮化时表皮爬行距离存在差异)、个体皮肤差异和愈合能力不同等；小白鼠皮肤从切创到完全愈合所用时间约为19 d，与兔子痊愈时间大致相同。通过对小白鼠创伤面积的统计，在创伤恢复的整体时间中，马齿苋组的创面面积比丁二醇组的小，且差异有统计学意义；与云南白药组对比差异无统计学意义，说明马齿苋合剂对小白鼠创面具有良好的修复作用。家兔与小白鼠试验结果表明，马齿苋合剂对皮肤缺损性创伤有良好的消炎、促进上皮组织的再生及促进创伤愈合的作用。

同时，本实验存在一定的局限性，人为切创时存在一定的误差，直接导致切创第2 天小鼠皮肤创伤面积与对照组差异有统计学意义；实验动物购买及饲养成本较高，孕育周期长，出生率低，且饲养技术不如专门的饲养员技术，直接限制本实验样品数量和质量。马齿苋合剂药源广，价格便宜，使用方便，制作简单，天然无毒副作用，可作为动物创伤的必须药物而应用于外科临床。下一步将从细胞生物学水平及分子生物学方面，研究马齿苋合剂对创伤修复机制中重要的相关因子的影响。

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Curative effect of traditional Chinese medicine extraction containing mainlyPortulacaoleraceaL.onexperimentalskin defected wounds

YANG Chunhua,HE Pengliang,LI Ruihang,et al

(CollegeofBiologicalScienceandTechnology,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing,Heilongjiang163319,China)

ObjectiveTo investigate the curative effect of the traditional Chinese medicine mixture ofPortulacaoleraceaL. on experimental animal models of skin defected wounds.MethodsThe fresh aerial parts of domesticated cultivardutchportulacaoleraceaL.were collected in order to extract effective constituent by coarse grind and filter.The extraction was mixed with several compositions of natural ingredients such asLedumpalustre,CosmosbipinnataCavand honey in excipient.Twenty white rabbits or 30 Balb/c mouses were randomized into three groups and treated respectively with Purslane mixture(experimental group),Yunnan Baiyao Ointments(positive control),and Butylene Glycol(negative control),and then,20 mg or 10 mg of external preparation was administered to each of model animal with skin trauma on his back,followed by daily inspection.ResultsThe experimental group,compared with positive control group,showed a non-significant difference(P>0.05) in reducing granulation tissue formation and epithelial regeneration,but only recovered slightly slower for averagely 1 days to 2 days in the same conditions.However,there was a significantly improved therapeutic advantage(P<0.05) when compared with the negative control group.ConclusionsPurslane mixture has a high potential as a novel alternative therapeutic strategy after skin injury.

Portulaca oleracea;Yunnan bai yao;Administration,cutaneous;Soft tissue injuries;Rabbits;Mice,inbred BALB C

黑龙江省教育科学"十二五"规划课题(GBC1212060);黑龙江八一农垦大学“大学生创新创业训练计划”项目(XC2015050)

于永忠，男，副教授，硕士生导师，研究方向：分子免疫学，E-mail：yyz1968@126.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.005

2016-03-02，

2016-06-07)