枣类黄酮化合物的快速提取方法

张 琼　周广芳　王中堂　单公华　刘孟军　刘 平*

(1 山东省果树研究所， 山东 泰安 271000)(2 河北农业大学中国枣研究中心， 河北 保定 071001)



枣类黄酮化合物的快速提取方法

张 琼1,2周广芳1*王中堂1单公华1刘孟军2刘 平2*

(1 山东省果树研究所， 山东 泰安 271000)(2 河北农业大学中国枣研究中心， 河北 保定 071001)

针对枣类黄酮化合物提取中存在的耗时长、含糖量高等问题，以“鲁枣1号”为试材，采用紫外分光光度计和高效液相色谱进行枣类黄酮化合物的快速提取方法研究。本研究从提取质量、化合物数量、提取时间等多方面综合比较溶剂超声浸提法、融冻微波破壁法和简化QuEChERS法的提取效果，确定枣类黄酮化合物的快速提取方法。研究表明：简化QuEChERS法可在30 min内有效提取枣类黄酮。具体步骤为：样品加水涡旋5 min，然后加乙腈振荡15 min，最后加NaCl离心分层，取上层乙腈相。整个过程历时30 min，可有效去除部分糖类物质。该方法简单、快速、有效。

枣；类黄酮；简化QuEChERS法；快速提取

枣(Ziziphus jujuba Mill.)是原产中国的具有极高的食用、药用、经济、生态和科研价值的树种，是我国第一大干果树种，其产量占世界枣总产量的99%以上，因此其开发与利用占有绝对的市场优势。

枣中除含有丰富的多糖、维生素、膳食纤维、环磷酸腺苷等功能物质，还含有丰富的类黄酮类物质[1-4]。类黄酮具有很强的抗氧化、清除自由基能力，具有抗癌、抗衰老、抗炎、改善心脑血管脆性等生理功能，其中一些类黄酮化合物已被批准用作医药品，例如芦丁已是一种毛细血管脆性及静脉曲张状态的治疗药物。另外，类黄酮对植物体本身也有一定的调节作用，可以作为酶抑制剂、对植物有害的金属的螯合剂以及还原剂等[5]。因此，充分开发与利用类黄酮，尤其是占世界总产量99%的枣中的类黄酮，具有重要的现实意义与广阔的发展前景。

开发枣类黄酮首先要明确枣中含有的类黄酮物质种类，常采用高效液相色谱与质谱对提取液进行分离鉴定，目前枣类黄酮的提取方法有有机溶剂提取法、超声波提取法、融冻微波破壁提取法等，但枣中的糖含量很高，以上方法提取出的类黄酮提取液中含有大量的可溶性糖等杂质，且耗时长，不利于进一步的检测。因此，需要建立一种简单、高效、快速的除杂、利于检测的提取方法。

QuEChERS是近年来国际上最新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术，其步骤简单归纳为样品粉碎→乙腈提取分离→盐析除水→吸附剂除杂→上清液检测。该方法具有操作简单、精确度和准确度高等优点，在农残检测中被广泛应用。

本文以自主选育品种“鲁枣1号”为试材，借鉴QuEChERS样品前处理方法，并对其进行简化用于提取枣类黄酮化合物，并比较简化QuEChERS法与超声波提取及融冻微波破壁提取效果，旨在为枣类黄酮的开发与利用奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1材料

供试材料为自主选育的极早熟优良品种“鲁枣1号”，于2014年8月5日采于山东省果树研究所枣资源圃，选取成熟度一致、大小均匀的果实，采后带回实验室，用水冲去果面浮尘，削成1 mm薄片，液氮速冻后研磨成粉末状，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2枣类黄酮提取的不同方法

1.2.1超声波提取法

称取枣样品1 g，加入20 mL 60%乙醇水溶液，超声提取40 min，离心取上清液，重复1次。

1.2.2融冻微波破壁提取法

称取枣样品1 g，加入20 mL 40%乙醇水溶液，置于-20℃冰箱中冷冻，至溶液完全冻结，取出，低火微波提取2min，离心取上清液，残渣重复冻结微波提取1次。

1.2.3简化QuEChERS提取法

称取枣样品1 g，加入10 mL蒸馏水，涡旋1 min后加入20 mL乙腈，超声提取10 min，加入3. 6 g氯化钠，摇匀静置，10 000转/分离心取上清液，重复提取1次，合并两次的上清液，得待测液。

1.3类黄酮含量的测定

以芦丁为标准品，采用硝酸铝比色法进行含量测定。取1 mL待测液置于10 mL试管中，加入5%亚硝酸钠水溶液0. 3 mL，摇匀，静置5 min，再加入10%硝酸铝水溶液0. 3 mL，摇匀，静置6 min，最后加入4%NaOH溶液4. 0 mL，摇匀，用30%乙醇水溶液定容至刻度，静置15 min后，于波长500nm处测定其吸光度，计算其含量。

1.4HPLC的检测条件

提取液过0. 22 μm微孔滤膜，进行HPLC检测。检测条件参考张琼(2010)[6]的方法，具体为：HPLC(安捷伦1200)，反向C18色谱柱(LiChroCART，250×4. 6 mm i.d.)，柱温30 ℃，流动A为乙腈，流动相B为1%甲酸水溶液，梯度洗脱。

1.5数据分析

不同提取方式提取出的类黄酮含量的比较采用Excel 2007进行分析。

2　结果与分析

2.1提取效率的比较

本试验共采用3种方法提取枣类黄酮，分别为简化QuEChERS提取法、超声波提取和融冻微波破壁提取，第一种提取方法是借鉴农残检测前处理方法QuEChERS法，将其进行简化，其余两种方法较常用。图1为3种提取方式提取出来的类黄酮物质的含量比较，以超声波提取的类黄酮含量最高，为2. 54 mg/g，简化QuEChERS提取的类黄酮含量最低，为2. 28 mg/g，但经方差分析三者未见明显差异，说明简化QuEChERS法法与其它两种常用方法提取量相当，但该方法的提取时间较其它方法明显减少，仅需30 min。融冻微波破壁提取过程微波提取所需时间虽然较少，但需先将样品冷冻，此过程较为耗时。

图1　简化QuEChERS法、超声波提取法、融冻微波破壁提取法提取类黄酮含量比较

2.2色谱分离效果比较

因融冻微波破壁提取法与简化QuEChERS法提取到的枣黄酮醇含量相当，而提取总用时较简化QuEChERS法多，因此色谱分离效果比较试验中只对简化QuEChERS法和提取量最高的超声提取法获得的提取液进行了HPLC检测，比较其分离效果。如图2所示，在相同液相条件下，均可在两种方法的提取液中检测到8种类黄酮物质，但超声波提取液在HPLC检测中杂峰较多，而简化QuEChERS法提取液检测到的杂峰很少，说明后一种方法提取更有利于枣类黄酮的提取分离分析。

图2　超声波提取和简化QuEChERS法提取所得样品提取液的高效液相色谱图

3　讨论与结论

枣的含糖量非常高，鲜枣含糖量幅度在13. 0%～35. 03%[7]，而干枣含糖量可达80. 86%～85. 63%，在类黄酮提取过程中，部分糖类物质得以析出，对类黄酮的提取分离影响很大。而本试验中提到的简化QuEChERS法是基于盐析液-液萃取技术的一种提取方法，是指在可与水混溶的有机溶剂的水溶液中加入盐，利用目标分析物和糖类杂质在水相和有机相中的溶解度不同，盐析可使提取液分相，将目标分析物萃取到有机相中，达到快速分离纯化的目的。目前，类似原理的类黄酮提取方法已在金银花、银杏等植物上得以应用，效果理想[8,9]。

用乙腈-水混合溶液作为提取剂，可使枣中的类黄酮与可溶性糖等物质在短时间内有效分离，提纯待测液，且提取剂与色谱、质谱流动相相匹配，不会出现明显的试剂峰，利于成分分离与鉴定。具体步骤为：样品加水涡旋5 min，之后加乙腈振荡15 min，最后加NaCl离心分层，取上层乙腈相即得枣类黄酮提取液。简化QuEChERS法可在30 min内有效提取枣类黄酮，简单、快速、有效，是一种利于分离鉴定检测的快速提取枣类黄酮的方法。但鉴于乙腈的毒性，该方法不适用于生产，非常适用于实验室进行物质的快速分离与鉴定及其他相关试验。

[1]彭艳芳. 枣主要活性成分分析及枣蜡提取工艺研究[D]. 保定：河北农业大学, 2008.

[2]郭盛. 中国大枣资源化学研究[D]. 南京：南京中医药大学, 2009.

[3]黄微, 徐瑞晗, 程妮, 等. 红枣生物活性成分的研究进展[J]. 食品研究与开发, 2012, 33(4)：198-201.

[4]鲁周民, 刘坤, 闫忠心, 等. 枣果实营养成分及保健作用研究进展[J]. 园艺学报，2010, 37(12)：2017-2024.

[5]唐传核. 植物生物活性物质[M]. 北京：化学工业出版社，2005：218-249.

[6]张琼, 周广芳, 沈广宁, 等. 冬枣果皮着色过程中类黄酮类物质成分及含量的变化[J]. 园艺学报，2010, 37(2)：193-118.

[7]郭裕新，单公华. 中国枣[M]. 上海：上海科技出版社，2010.

[8]李萍. 一种基于固相提取技术的银杏叶制剂分析样品快速制备方法[P]. 中国，N103323558B.2014-12-10.

[9]余顺火. 从葛根废弃料中快速提取葛根异黄酮的方法[P]. 中国，CN102961436A. 2013-03-13.

A Rapid and Efficient Extraction Method of Flavonoids from Ziziphus jujuba Fruits

Zhang Qiong1,2Zhou Guangfang1*Wang Zhongtang1Shan Gonghua1Liu Mengjun2LiuPing2*

(1 Shandong Institute of Pomology, Taian, Shandong 271000) (2 Research Center of Chinese Jujube, Agricultural University of Hebei, Baoding, Hebei 071001)

The objective of this study was to develop a simplified and rapid procedure for flavonoids extraction from jujube fruits. Flavonoids were extracted from the ripe edible fruits of jujube(Ziziphus jujuba ' Luzao 1' )using three methods, which were ultrasonic extraction, microwave-frozen-melted disintegrating method and simplified QuEChERS method. The extraction effects were comprehensively evaluated from quantity, quality and time by Uv-vis spectrophotometry and high-performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that the simplified QuEChERS method was optimal. Detailed procedures were as follows: the grinded jujube fruits in liquid nitrogen were eluted by water for 5 minutes, and then acetonitrile was added to oscillate for 15 minutes. After oscillation, NaCl was added to the extracts. By centrifugal separation, the extracts were turned into two layers, the upper acetonitrile layer contained all the flavonoids. The entire procedure can be carried out in approximately 30 minutes, and effectively eliminate some saccharide. The simplified QuEChERS method is easy, rapid and efficient.

Ziziphus jujuba Mill; flavonoids; simplified QuEChERS method; rapid extraction

2015-08-02

山东省农业良种工程(2014LZ12);山东省果树研究所所长基金(2013KY01);山东省农业科学院青年科研基金(2014QNM34)。

张琼(1982-)，女，在读博士，助理研究员，研究方向为枣品种选育及营养研究。E-mail：qiong1982@163.com

�E-mail：gkskyb@sina.com

1009-0568(2016)03-0037-04

S662.9

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2016.03.007