硫酸庆大霉素中RNA和DNA的检查

杨帆夏云空刘晓薇席德慧

（1.四川大学生命科学学院 四川成都 610042； 2.成都蓉生药业有限责任公司 四川成都 61000）

硫酸庆大霉素中RNA和DNA的检查

杨帆1，2夏云空2刘晓薇2席德慧1

（1.四川大学生命科学学院 四川成都 610042； 2.成都蓉生药业有限责任公司 四川成都 61000）

目的 为检查硫酸庆大霉素中的RNA与DNA，方法 先用凝胶柱色谱法分离出RNA与DNA，再采用改良苔黑酚法检查RNA，采用二苯胺法检查DNA。结果 RNA在1～20μg范围内，吸光度与浓度线性回归的相关系数r=0.9993，检测限和定量限分别为0.28μg和0.85μg，平均回收率为96.1%；DNA在5～200μg范围内，吸光度与浓度线性回归的相关系数r=0.9995，检测限和定量限分别为2.8μg和6.3μg，平均回收率为93.3%。结论 所建立的方法专属、灵敏、准确，可用于硫酸庆大霉素中RNA 和DNA的检查。

硫酸庆大霉素 RNA DNA 凝胶柱色谱法 改良苔黑酚法 二苯胺法

1 实验部分

1.1 仪器与试药

UV-1800PC 紫外-可见分光光度计（上海MAPADA）；

RNA对照品（酵母核糖核酸，中国科学院上海生物化学研究所，含磷量大于7.0%）；

DNA对照品（小牛胸腺DNA，XIASI BIO公司生产）；

葡聚糖凝胶（Sephadex G-50）；

其他试剂均为分析纯。

1.2 方法与结果

1.2.1 RNA的检查

采用改良苔黑酚法检查本品中的RNA。改良苔黑酚法是利用RNA与盐酸共热，发生降解并生成糖醛，在铜离子的催化下，糖醛可与苔黑酚（3，5-二羟基甲苯）反应，生成绿色产物，在670nm有最大吸收，采用比色法测定［2］。由于硫酸庆大霉素对检查有干扰，采用凝胶柱色谱法分离出RNA后，再进行检查。

1.2.1.1 测定方法

苔黑酚铜离子试液的配制：

试液A：称取苔黑酚5.0g，，溶解于10ml 95%的乙醇中，摇匀；

试液B：称取氯化铜0.15g，溶解于100ml浓盐酸中，摇匀；

临用前，量取试液A 1ml 与试液B 100ml，混匀，即得。

对照品溶液的制备：准确称取RNA对照品10.0mg，置10ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，即得。（0.01mg/ml）

凝胶柱的制备：取葡聚糖凝胶（Sephadex G-50）20g，加水适量使溶胀，用水冲洗数次，装于玻璃柱（25×1.5cm；有效柱长约16. 5cm）内，待凝胶自然沉降完全后，加3倍于柱体积的水洗涤，备用。

供试品溶液的制备：称取硫酸庆大霉素样品1.0g，置10ml量瓶中，加水适量，振摇使溶解，再加水稀释至刻度，摇匀（100mg/ml）；量取上述溶液1.0ml，加于预先装好的凝胶柱上，以水为洗脱剂洗脱，流速为0.25ml/min，弃去初流出液8ml，收集续流出液8ml，备用。

测定方法：按下表配制好溶液后，同置沸水浴内加热35min，放冷后，以6号管为空白，在670nm波长处测定吸光度，用标准曲线法计算样品中R N A的含量。

1.2.1.2 方法的考察

（1）线性和范围

按1.2.1.1项下方法配制不同浓度的对照品溶液，测定吸光度，以吸光度（A）对RNA的量（X）进行线性回归， 结果表明，吸光度与浓度呈良好的线性关系。

（2）检测限和定量限

采用空白信号标准差法测定。取空白溶液，重复测定3次，测得吸光度分别为0.001、0.000和0.000。计算得空白信号标准差σ为5.8× 10-4。

表1 RNA的测定方法 单位：ml

表2 RNA测定回收试验的结果

表3 样品中RNA的测定结果

表4 DNA的测定方法 单位：ml

表5 DNA测定回收试验的结果

表6 样品中DNA的测定结果

（3）回收试验 准确称取已测定RNA含量的硫酸庆大霉素1.0g，加入高低两种浓度的RNA对照品溶液，按1.2.1.1项下方法测定RNA的含量，并计算回收率，结果见下表：

1.2.1.3 样品中RNA的测定

称取硫酸庆大霉素1.0g，按1.2.1.1项下的方法测定，结果见下表：

1.2.2 DNA的检查

采用二苯胺法检查本品中的DNA。二苯胺法是利用DN A在酸性溶液中加热降解，生成2’-脱氧核糖并形成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂反应，生成蓝色化合物，在595nm有最大吸收，采用比色法测定［2］。由于硫酸庆大霉素对检查有干扰，所以采用凝胶柱色谱法分离出DNA后，再进行检查。

1.2.2.1 测定方法

二苯胺试液的配制：

试液A：称取二苯胺0.4g，加冰醋酸90ml使溶解，加高氯酸4ml，混匀；

试液B：量取40%的乙醛溶液1.0ml，加水稀释至25ml，混匀；

临用前取A液，加B液0.4ml，混匀，即得。

对照品溶液的制备：准确称取DNA对照品10.0mg，置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度；精密量取上述溶液1ml，置10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，即得。（0.1g/ml）

凝胶柱的制备与供试品溶液的制备：同1.2.1 RNA测定项下。

测定方法：按下表配制好溶液后，置60℃水浴中加热1.5h，放冷，以6号管为空白，于595nm波长处测定吸光度，用标准曲线法计算样品中D N A的含量。

1.2.2.2 方法的考察

（1） 线性和范围 按1.2.2.1项下方法配制不同浓度的对照品溶液并测定吸光度，以吸光度对DNA的量进行线性回归，结果表明，吸光度与浓度呈良好的线性关系。

（2） 检测限和定量限

空白信号的测定：采用空白信号标准差法测定。取空白溶液（同1项下的9#溶液），重复测定3次，测得吸光度分别为0.000、0.001和0.000。计算得空白信号标准差σ为5.8×10-4。

（3）回收实验：准确称取已测定DNA含量的硫酸庆大霉素1.0g，加入高低两种浓度的DNA对照品溶液，按1项下方法测定DNA的含量，并计算回收率，结果见表7：

1.2.2.3 样品中DNA的测定

称取硫酸庆大霉素1.0g，按1.2.2.1项下的方法测定，结果如下：

1.3 讨论

1.3.1 由于硫酸庆大霉素对检查有干扰，所以采用凝胶柱色谱法分离出核酸后，再进行检查。选择葡聚糖凝胶（Sephadex G-50）进行分离，RNA和DNA分子量较庆大霉素大，在分离过程中为全排阻，首先被洗脱。分别取核酸对照品溶液和硫酸庆大霉素溶液，加于葡聚糖凝胶柱上，收集洗脱液，用紫外分光光度法监测，确定组分的保留体积。结果表明，在实验条件下，死体积约为8ml，两种核酸在随后的8ml内被洗脱，庆大霉素随后被洗脱，核酸和庆大霉素可以完全分离。

［1］华维一.药物化学［S］. 北京：高等教育出版社，2004.

［2］赵亚华.生物化学实验技术教程.广州：华南理工大学出版社，2000.

Determination of RNA and DNA in Gentamicin Sulfate

YANG FAN1，2
（1.College of live scienen Sichuan university，Chengdu， 610041 China；2.Chengdu rongshen pharmaceuticals co.， Chengdu，610000 China）

Objective： To determine RNA and DNA in Gentamicin Sulfate， Methods： RNA and DNA were separated by gel chromatography and determined with improved orcinol colorimetry and diphenylamine colorimetry， respectively. Results： For RNA determination， the linear range was 1～20 μ g （r=0.9993）. LOD and LOQ were 0.28μg 0.85μg， respectively. The average recovery was 96.1%. For DNA determination， the linear range was 5～200 μg （r=0. 9995）. LOD and LOQ were 2.8μg 6.3μg， respectively. The average recovery was 93.3%. Conclusion： The methods were specific， sensitive， accurate and suitable for determination of RNA and DNA in Gentamicin Sulfate.

Gentamicin Sulfate； RNA； DNA； Gel chromatography； Improved orcinol colorimetry； Diphenylamine colorimetry

R917

A

1674-2060（2016）02-0166-02

杨帆，男，汉族，现从事于血液制品行业，就职于成都蓉生药业有限责任公司，具有多年的生产工作经验，同时为四川大学生命科学学院2012级在职研究生。