正交试验优化杠板归的蜜炙工艺

沈 伟，路立峰，李赫宇（1.山东中医药高等专科学校科研处，山东烟台 64199；.山东药品食品职业学院中药系，山东威海 6410；.天津市益倍建生物技术有限公司，天津 00457）

正交试验优化杠板归的蜜炙工艺

沈 伟1＊，路立峰2，李赫宇3（1.山东中医药高等专科学校科研处，山东烟台 264199；2.山东药品食品职业学院中药系，山东威海 264210；3.天津市益倍建生物技术有限公司，天津 300457）

目的：优化杠板归的蜜炙工艺。方法：以有效成分槲皮素和水溶性浸出物的含量为综合评价指标，选取蜂蜜用量、闷润时间、烘制温度及烘制时间为考察因素，采用L（934）正交试验优化杠板归的蜜炙工艺并进行验证试验。结果：最优蜜炙工艺条件为取杠板归药材加蜂蜜30%，闷润120 min，70 ℃温度下烘制50 min。验证试验中制备的3批炙杠板归的槲皮素含量均大于0.05%，水溶性浸出物含量均大于25%（RSD均＜2.5%，n=3）。结论：优化的炮制工艺稳定、可行，为规范杠板归饮片的蜜炙操作与成品质量控制提供了一定的参考依据。

杠板归；蜜炙工艺；正交试验；槲皮素；水溶性浸出物

杠板归，收载于2015年版《中国药典》（一部）中，又名扛板归、犁尖草、蛇牙草、贯叶蓼、河白草、刺蓼、蛇倒退等，系蓼科植物杠板归Polygonum perfoliatum L.的干燥地上部分，味酸，性微寒，归肺、膀胱经，具有清热解毒、利水消肿、止咳的功能，主治咽喉肿痛、肺热咳嗽、小儿顿咳、水肿尿少、湿热泻痢、湿疹、疖肿、蛇虫咬伤等［1］，主要含有黄酮类、蒽醌类、苯丙素类、萜类、酰胺类和其他类化合物［2-3］。现代药理实验结果表明，杠板归具有抗炎、祛痰止咳、抗菌、保肝、抗疱疹病毒、抗肿瘤等活性作用［4-6］，其在全国各地均有分布，民间常用单味杠板归蜜炙品或复方制剂治疗咽喉肿痛、肺热咳嗽、小儿顿咳（百日咳）等症，效果显著［7-8］。目前应用最多的饮片为生品杠板归和蜜炙杠板归，明代陈嘉谟在《本草蒙筌》有“蜜制甘缓难化，增益元阳”的论述，意即蜜炙后能增强药物的润肺祛痰、止咳平喘、补中益气之功。但蜜炙杠板归的工艺尚不规范，《中国药典》、全国及各省中药炮制规范均未规定杠板归的炮制工艺及技术参数，各地饮片质量差异较大。本试验在传统蜜炙操作的基础上，以杠板归有效成分槲皮素和水溶性浸出物的含量为综合评价指标，采用正交试验法，对蜂蜜用量、闷润时间、烘制温度及烘制时间4个因素进行考察，优化其恒温干燥条件下的蜜炙工艺，为炙杠板归的炮制与饮片的质量控制提供科学依据与参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-2010AHT高效液相色谱仪、LC Solution色谱工作站、恒温柱箱、自动进样器、紫外检测器（日本岛津公司）；R200D十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 药材、对照品与试剂

杠板归饮片（亳州市滕王药业有限责任公司，批号：2014-0816，经山东中医药高等专科学校中药鉴定教研室张钦德教授鉴定为蓼科植物杠板归的干燥地上部分）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100081-200907，纯度：＞98%）；蜂蜜（北京百花蜂业科技发展股份公司，批号：20140603，食用级）；甲醇为色谱纯；磷酸、乙醇为分析纯；水为双蒸水并经0.45 μm水系滤膜过滤。

2 方法与结果

2.1 炼蜜的制备

取蜂蜜适量，先用中火加热至微沸，再用文火加热，使温度达116～118 ℃，至满锅起鱼眼泡、手捻有黏性、两指间尚无长白丝出现，即可［9］。

2.2 蜜炙杠板归的制备

取炼蜜适量，加入至净杠板归饮片中拌匀，闷润适当时间，单层平铺于不锈钢托盘上，置于恒温干燥箱中适当温度下烘至一定时间，取出，放凉，即得。

2.3 槲皮素含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Hypersil ODS2 C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温为35 ℃；流动相为甲醇-0.4%磷酸（50∶50），流速为1.0 ml/min；检测波长为360 nm；进样量为10 μl；理论板数按槲皮素峰计应不低于4 000。在上述色谱条件下，取“2.3.2”“2.3.3”项下对照品溶液、供试品溶液和空白溶液进样分析，结果表明槲皮素与其他组分分离良好，详见图1。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素对照品（120 ℃干燥4 h）适量，用甲醇溶解并定容至5 ml量瓶中。精密吸取上述溶液1.25 ml用甲醇定容至100 ml量瓶中，得12.506 mg/L的对照品溶液。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.3.3 供试品溶液和空白溶液的制备 取1号正交试验样品，粉碎，过三号筛；取约1.0 g，精密称定，置于250 ml烧瓶中，精密加入70%乙醇80 ml，称质量；置于90 ℃水浴中加热回流3 h，放冷，再称质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过；减压回收溶剂，浸膏用甲醇定容至25 ml量瓶中，超声10 min溶解，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液，即得。除不加入样品外，其余操作同上制备空白溶液。

2.3.4 线性关系及定量限考察 分别精密量取对照品溶液0.5、1、2、3、4、5 ml置于5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。进样测定，以峰面积（y）为纵坐标、质量浓度（x）为横坐标，得槲皮素回归方程为y=2.6×106x－4.7×103（R2=0.999 9）。结果表明，槲皮素检测质量浓度线性范围为1.25～12.5 μg/ml，定量限为0.125 μg/ml（信噪比为10）。

2.3.5 精密度试验 精密量取槲皮素对照品溶液10 μl，分别连续进样6次，进行测定。结果显示，槲皮素峰面积的RSD为0.15%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 精密量取1号正交试验供试品溶液10 μl，分别于0、2、4、6、12、24 h进样分析。结果显示，供试品溶液中槲皮素峰面积的RSD为0.27%（n=6），表明样品至少在24 h内基本稳定。

2.3.7 重复性试验 取同一炙杠板归饮片粉末（1号正交试验样品）6份，每份1.0 g，精密称定，测定并计算槲皮素含量，结果RSD为0.24%（n=6），表明方法重复性好。

2.3.8 回收率试验 取已知含量的同一炙杠板归饮片粉末（1号正交试验样品）6份，每份0.5 g，精密称定，各分别精密加入适量槲皮素对照品，混合均匀，依法提取，测定回收率。结果显示，槲皮素平均回收率为100.43%（RSD=1.34%，n=6），表明该方法准确度好。

2.4 水溶性浸出物含量测定

按照2015年版《中国药典》（四部）水溶性浸出物测定法（热浸法）［10］测定。称取炙杠板归粉末约4 g，加水80 ml进行试验。

2.5 综合评分标准

以综合加权评分法对蜜炙杠板归饮片质量进行评价，有效成分槲皮素含量、水溶性浸出物含量的加权系数分别设为0.7、0.3，槲皮素含量得分=槲皮素含量×70/9个样品中槲皮素最高含量；水溶性浸出物含量得分=水溶性浸出物含量×30/9个样品中水溶性浸出物最高含量；综合评分=槲皮素含量得分+水溶性浸出物含量得分。

2.6 正交设计优化杠板归蜜炙工艺

在预试验基础上，以炼蜜用量（与药材的质量百分比，A）、闷润时间（B）、烘制温度（C）、烘制时间（D）为考察因素，称取净选后的杠板归饮片9份，每份100 g，按L9（34）正交试验设计加入相应量炼蜜，拌匀，置于密闭容器中闷润不同时间后，单层平铺于不锈钢托盘上，转移至烘箱中，分别在规定烘制温度下烘制一定时间，取出，晾凉。测定槲皮素及水溶性浸出物含量并计算综合评分。每次试验平行做3次（n=3）。因素与水平见表1；正交试验设计与结果见表2；方差分析结果见表3。

表1 因素与水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交试验设计与结果Tab 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析结果Tab 3 Analysis results of variance

由极差R可知，4个因素对综合评分影响顺序为C＞D＞A＞B；因素A：k2＞k1＞k3，因素B：k3＞k1＞k2，因素C：k3＞k2＞k1，因素D：k3＞k2＞k1，可得杠板归最优蜜炙工艺为A2B3C3D3。

由方差分析可知，以因素B为误差项进行方差分析，结果显示因素C（烘制温度）对试验结果有显著性影响，因素A和因素D无显著性影响。

综合直观分析和方差分析结果确定，恒温干燥条件下蜜炙杠板归的最优工艺为A2B3C3D3，即加炼蜜30%，再加入净杠板归饮片，拌匀、闷润120 min，置于70 ℃温度下恒温烘制50 min，取出，晾凉，即得。

2.7 验证试验

取净杠板归3份，每份100 g，按优化的蜜炙工艺进行验证试验，分别测定槲皮素和水溶性浸出物含量。结果制备的3批炙杠板归槲皮素含量均大于0.05%，水溶性浸出物含量均大于25%，RSD均小于2.5%，表明本试验确定的恒温干燥条件下蜜炙杠板归的工艺科学、稳定、合理、可行，结果见表4。

3 讨论

表4 验证试验结果Tab 4 Results of verification test

传统蜜炙工艺多为炼蜜拌炒法，但炒制温度较难控制，温度过高则易造成饮片出现焦糊现象，温度过低则易导致饮片含水量过高、容易发霉、不便贮藏。本试验采用恒温干燥条件下的蜜炙工艺，相比传统法优点主要有三点：一是受热均匀，制得的饮片颜色鲜艳，有光泽，较酥脆，无焦糊现象；二是由于烘制时间较长，既能使饮片充分吸收辅料炼蜜，确保药物与炼蜜疗效协同增强，同时也能促使水分蒸发，使炮制饮片含水量适宜，易于贮藏保管；三是操作简便，温度易于控制，而且卫生清洁，降低了环境污染，可用于大批量杠板归饮片的蜜炙加工操作，并能保证成品质量。

槲皮素是一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗过敏、抗氧化、抗病毒等多方面生物活性。最新研究发现槲皮素可抑制人肺腺癌NCI-H1395细胞增殖［11］，是杠板归的主要有效成分。《中国药典》中对杠板归的质量控制亦采用槲皮素为指标成分。本试验采用综合评分法，综合了杠板归的有效成分槲皮素含量和水溶性浸出物含量两个指标，可以比较客观、综合地反映各个因素对炙杠板归饮片质量的影响。

本试验通过正交设计，考察了蜂蜜用量、闷润时间、烘制温度及烘制时间等因素对蜜炙杠板归效果的影响，优化了恒温干燥条件下杠板归的蜜炙工艺，为规范杠板归饮片的蜜炙操作与成品质量控制提供了一定的参考依据，同时对于该中药饮片生产企业的批量生产加工亦具有较高的借鉴价值。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：166.

［2］马青云，黄圣卓，李红芳，等.杠板归中化学成分生防活性研究［J］.湖北农业科学，2013，52（21）：5 245.

［3］成焕波，刘新桥，陈科力.杠板归乙酸乙酯部位化学成分研究［J］.中药材，2012，35（7）：1 088.

［4］邢煜君，王海燕，王俊霞，等.杠板归抗氧化作用及抑制α-葡萄糖苷酶活性［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（2）：189.

［5］张可锋，杜正彩，高雅，等.杠板归抗二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化的作用及其机制研究［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（16）：242.

［6］张长城，黄鹤飞，周志勇，等.杠板归提取物抗单纯疱疹病毒-Ⅰ型的药理作用研究［J］.时珍国医国药，2010，21 （11）：2 835.

［7］项秀荷.自拟杠百方治疗百日咳221例［J］.湖北中医杂志，2000，22（1）：36.

［8］罗荣泉.加味苇茎汤治疗咳嗽变异型哮喘52例［J］.新中医，2007，39（8）：70.

［9］刘波.中药炮制技术［M］.北京：人民卫生出版社，2014：176.

［10］国家药典委员会.中华人民共和国药典：四部［S］.2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：202.

［11］李林，王迪进，万轲，等.槲皮素对人肺腺癌NCI-H1395细胞凋亡的影响［J］.中国药房，2015，26（34）：4 786.

（编辑：刘 萍）

Optimization of Processing Technology of Honey-fired Polygonum perfoliatum by Orthogonal Test

SHEN Wei1，LU Lifeng2，LI Heyu3（1.Dept.of Scientific Research，Shandong College of Traditional Chinese Medicine，Shandong Yantai 264199，China；2.Dept.of Traditional Chinese Medicine，Shandong Drug and Food Vocational College，Shandong Weihai 264210，China；3.Tianjin Ubasichealth Nutrition Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

OBJECTIVE：To optimize the processing technology of honey-fried Polygonum perfoliatum.METHODS：The processing method of honey-fried P.perfoliatum was optimized by L（934）orthogonal test with the contents of effective component quercetin and water-soluble extract as comprehensive evaluation index，with the amount of honey，moistening time，baking temperature and baking time as investigating factors.RESULTS：The optimal processing technology was as follows as 30%honey，moistening for 120 min，baking for 50 min at 70 ℃.In verification test，the content of quercetin in 3 batches of honey-fried P.perfoliatum was higher than 0.05%，and the content of water-soluble extract was higher than 25%（RSD＜2.5%，n=3）.CONCLUSIONS：The optimized processing technology is stable and practical，and can provide reference for standardizing the processing technology and quality control of honey-fried P.perfoliatum.

Polygonum perfoliatum；Processing technology of honey-fried；Orthogonal test；Quercetin；Water-soluble extract

R285.2

A

1001-0408（2016）25-3561-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.25.32

2016-02-23

2016-04-14）

＊讲师，硕士。研究方向：中药化学、中药炮制学。电话：0535-5136962。E-mail：shenweitcm@163.com