丙酸睾酮与5-羟色胺对老年大鼠脊髓腰骶段年龄相关还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶阳性体表达的影响

宋　宇　董明岩

(锦州医科大学附属第一医院骨外科脊柱病区，辽宁　锦州　121000)



丙酸睾酮与5-羟色胺对老年大鼠脊髓腰骶段年龄相关还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶阳性体表达的影响

宋宇董明岩

(锦州医科大学附属第一医院骨外科脊柱病区，辽宁锦州121000)

目的探讨丙酸睾酮与5-羟色胺对老年大鼠脊髓腰骶段年龄相关还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶阳性体(ANB)表达的影响。方法选择无特定病原体级的SD大鼠进行析因设计：即LC 组(6 月龄，无干预对照)；LT 组(6 月龄，丙酸睾酮干预)；LS组〔6 月龄，5-羟色胺(HT)干预〕；MC组(21 月龄，无干预对照)；MT组(21月龄，丙酸睾酮干预)；MS 组(21 月龄，5-HT干预)；HC组(24 月龄，无干预对照)；HT组(24 月龄，丙酸睾酮干预)；HS 组(24月龄，5-HT干预)，每组8只。干预后，取大鼠脊髓腰骶段，观察ANB和一氧化氮合酶(NOS)的表达。结果ANB和NOS主要分布在大鼠脊髓腰骶段背侧部，随着大鼠的衰老，ANB的表达逐渐增多。丙酸睾酮干预组ANB表达要明显少于对照组。5-HT干预组ANB表达与无干预对照组无明显变化。随着大鼠的衰老，NOS的表达逐渐增少。丙酸睾酮干预组NOS表达要明显多于对照组，5-HT干预组NOS表达与无干预对照组无明显变化。各组脊髓腰骶段ANB和NOS含量呈负相关。结论脊髓腰骶段ANB的出现与衰老有关，随着机体的老化ANB的表达逐渐增多。脊髓腰骶段ANB的出现可能与体内衰老过程中睾酮的减少存在一定的关系，补充丙酸睾酮可以减少衰老过程中ANB的出现；而补充5-HT则未见类似效果。

丙酸睾酮；5-羟色胺；脊髓腰骶段；年龄相关还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶阳性体(ANB)

腰骶段脊髓对于调控人体的盆底肌发挥非常重要的作用〔1,2〕。随着人体衰老，腰骶段脊髓会呈现与机体年龄相关的退行性变化，伴发生殖器官、直肠和膀胱的功能衰退。一氧化氮(NO)是神经系统中发挥关键作用的信息物质〔3～5〕，其与众多生理活动相关联。老年患者盆腔脏器的生理功能异常与腰骶段脊髓NO及一氧化氮合酶(NOS)的表达有密切关系。衰老过程中腰骶段脊髓会出现与衰老程度相关的还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶阳性体(ANB)的表达上调〔6〕。而且，随着衰老，老年男性患者愈来愈经常出现泌尿功能障碍。参与调节人体排尿反射的神经中枢在腰骶段脊髓，故而推测腰骶段脊髓中ANB的表达能够影响人体排尿反射。此外，随着衰老，患者体内的雄激素——睾酮含量会逐渐降低〔7～9〕，腰骶段脊髓5-羟色胺(HT)在泌尿反射中发挥重要作用〔10〕。本文探讨丙酸睾酮与5-HT对老年大鼠脊髓腰骶段ANP表达影响的分子生物学机制。

1　材料和方法

1.1实验动物选择无特定病原体级(SPF)SD大鼠，在实验大鼠繁育到第6个月时选用，体重275～300 g，由辽宁医学院的动物实验部提供(合格批准文号：动012)。标准的大鼠饲料(鼠粮由动物中心提供)喂养，自由摄食与饮水。本实验方案经辽宁医学院的伦理审查委员会的审查批准，并且全部操作按照动物实验相关的经典指南来严格地执行。

1.2分组LC组(6月龄，无干预对照)；LT组(6月龄，丙酸睾酮干预)；LS组(6月龄，5-HT干预)；MC组(21月龄，无干预对照)；MT组(21月龄，丙酸睾酮干预)；MS 组(21月龄，5-HT干预)；HC组(24月龄，无干预对照)；HT组(24月龄，丙酸睾酮干预)；HS 组(24 月龄，5-HT干预)。每组8只。

1.3仪器与试剂色谱级纯品L-谷氨酸(美国Sigma公司)；Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。

1.4干预措施无干预对照：通过背部皮下注射芝麻油作为安慰剂，给药剂量为2.0 mg·kg-1·d-1，每天1 次，连续3个月；丙酸睾酮干预：通过背部皮下注射睾酮制剂，给药剂量为2.0 mg·kg-1·d-1，每天1 次，连续3个月；5-HT干预：通过背部皮下注射5-HT，给药剂量2.0 mg·kg-1·d-1，每天1 次，连续3个月。

1.5观察指标〔4〕脊髓腰骶段ANB、NOS的表达情况。

1.6取材干预结束后，取材前8 h禁食，但同时不禁水，尾静脉注射1.5 g/kg 20%麻醉剂脲乙烷麻醉后，使用自制的大鼠专用的断头台迅速断头取出腰骶段脊髓组织；在去除二乙基焦炭酸盐的冰面之上，充分吸去腰骶段脊髓组织的血迹。称重，加1 ml甲醇-水配制的离心液，低温下匀浆处理，继而取出一部分的匀浆液置于4℃ ，以12 000 r/min进行15 min的离心处理，最后取出上清液，再经滤膜的过滤处理之后，将其放置在-80℃冰箱保存待测。

1.7色谱法检测神经递质谷氨酸的海马内浓度①将取材完毕的大鼠的海马组织置于匀浆器之内匀浆处置取其上清液备用。②选用测试所需的标准品和辅助实验试剂，包括邻苯二甲醛和色谱级甲醇。③调试色谱系统至工作状态，选用低温型高速离心机和色谱测试系统及色谱测量分析工作站。④调整色谱测试条件，即将色谱测试柱的温度调节为35℃，设定A流动相为0.1 mol/L醋酸钾，设定B流动相为色谱级甲醇。第五步骤实施洗脱程序(二元的梯度洗脱)，采用标准的二元的梯度洗脱程序。⑤测试所需蛋白(色谱测试过程中用作标准液)，选用Eppendorf 3810型微量离心管，在测试离心管中加入待测的样品本溶液100 μl(提前调定好浓度)和衍生试剂100 μl(已经调定好浓度)，反应持续2 min，再次加入已经调定好浓度的样品本溶液20 μl。⑥绘制测试蛋白的标准曲线，测定待测样本的含量。

1.8统计学处理采用SPSS19.0软件行χ2检验和方差分析。

2　结　果

2.1各组脊髓腰骶段ANB的含量ANB主要分布在大鼠脊髓腰骶段背侧部，并且随着大鼠的衰老，ANB的表达逐渐增多(P<0.05)。各丙酸睾酮干预组ANB表达要少于对照组(P<0.05)。5-HT干预组ANB表达较无干预对照组无明显变化(P>0.05)(表1)。

2.2各组脊髓腰骶段NOS的含量NOS主要分布在大鼠脊髓腰骶段背侧部，并且随着大鼠的衰老，NOS的表达逐渐增少(P<0.05)。各丙酸睾酮干预组NOS表达要多于对照组(P<0.05)。5-HT干预组NOS表达较无干预对照组无明显变化(P>0.05)(表2)。

表1　各组脊髓腰骶段ANB含量

1)与无干预对照组比较：P<0.05，2)主效应；3)交互效应；下表同

表2　各组脊髓腰骶段NOS含量

2.3各组脊髓腰骶段ANB和NOS含量相关性LC、LT、LS、MC、MT、MS、HC、HT、HS组脊髓腰骶段ANB和NOS含量呈负相关(r=-0.96、-0.95、-0.85、-0.90、-0.89、-0.97、-0.96、-0.91、-0.88，均P<0.05)。

3　讨　论

雄激素在保持机体的肌肉量和机体代谢方面具有重要功能。本研究结果提示ANB表达量的增多与随年龄增长导致睾酮的减少有密切关系。本文中高龄大鼠腰骶段脊髓的ANB的表达量亦有下降的趋势，但其下降幅度较小，其原因可能是在补充丙酸睾酮时老年大鼠脊髓腰骶段已经表达了较多的ANB，此时难以完全缓解这一趋势。NO在外周和中枢神经系统中具有重要的信号转导作用。NOS是NO生成的关键酶，在NO发挥的众多生理与病理作用的过程中，起着非常重要的调节作用，因此经常通过检测NOS活性来间接反映NO的含量〔11,12〕。本文结果提示，5-HT可能没有深切参与控制排尿的神经回路或者泌尿道神经活动。

1Rejc E,Angeli C,Harkema S,etal.Effects of lumbosacral spinal cord epidural stimulation for standing after chronic complete paralysis in humans 〔J〕.PLoS One,2015;10(7):e0133998.

2Hofstoetter US,Danner SM,Freundl B,etal.Periodic modulation of repetitively elicited monosynaptic reflexes of the human lumbosacral spinal cord 〔J〕.J Neurophysiol,2015;114(1):400-10.

3Oku H,Morishita S,Horie T,etal.Nitric oxide increases the expression of aquaporin-4 protein in rat optic nerve astrocytes through the cyclic guanosine monophosphate/protein kinase G pathway 〔J〕.Ophthalmic Res,2015;54(4):212-21.

4Stojanovic M,Scepanovic L,Hrncic D,etal.Multidisciplinary approach to nitric oxide signaling:focus on the gastrointestinal and the central nervous system 〔J〕.Vojnosanit Pregl,2015;72(7):619-24.

5宋晓晶，张栋，马慧敏，等.电针对小鼠肝组织内ET-1、NO含量的影响〔J〕.中华中医药杂志,2011;26(9):1978-81.

6周晨明.老年大鼠脊髓腰骶段 ANB 表达及相关特性〔D〕.石家庄：河北医科大学,2012.

7Hoyos CM,Yee BJ,Phillips CL,etal.Body compositional and cardiometabolic effects of testosterone therapy in obese men with severe obstructive sleep apnea:a randomized placebo-controlled trial 〔J〕.Eur J Endocrinol,2015;173(5):167531-41.

8Malan NT,Smith W,von Känel R,etal.Low serum testosterone and increased diastolic ocular perfusion pressure:a risk for retinal microvasculature 〔J〕.Vasa,2015;44(6):435-43.

9Shiota M,Takeuchi A,Sugimoto M,etal.Low serum testosterone but not obesity predicts high gleason score at biopsy diagnosed as prostate cancer in patients with serum PSA lower than 20 ng/ml 〔J〕.Anticancer Res,2015;35(11):6137-45.

10Noga BR,Johnson DM,Riesgo MI,etal.Locomotor-activated neurons of the cat.Ⅰ.Serotonergic innervation and colocalization of 5-HT7,5-HT2A,and 5-HT1A receptors in the thoraco-lumbar spinal cord 〔J〕.J Neurophysiol,2009;102(3):1560-76.

11Pereira-Suárez AL,Alvarado-Navarro A,Barrietos-GarcIa JG,etal.Differential expression of solute carrier family 11a member 1 and inducible nitric oxide synthase 2 in skin biopsies from leprosy patients 〔J〕.Indian J Dermatol Venereol Leprol,2015；81(6):594-9.

12Saito Y,Fujii Y,Yashiro M,etal.Inhibitory effects of edaravone,a free radical scavenger,on cytokine-induced hyperpermeability of human pulmonary microvascular endothelial cells:a comparison with dexamethasone and nitric oxide synthase inhibitor 〔J〕.Acta Med Okayama,2015;69(5):279-90.

〔2015-01-19修回〕

(编辑杜娟)

董明岩(1963-)，男，硕士，主任医师，主要从事骨脊柱疾病研究。

宋宇(1989-)，男，在读硕士，主要从事脊柱退行性变研究。

R744.6

A

1005-9202(2016)17-4178-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.019