电针对CUMS大鼠前额皮层星形胶质细胞GS、EAAT1、EAAT2的影响

罗　丁　张雪淳　肖　瑶　刘　月　王　琳　符文彬

(广州中医药大学第二临床医学院，广东　广州　510405)



电针对CUMS大鼠前额皮层星形胶质细胞GS、EAAT1、EAAT2的影响

罗丁1张雪淳肖瑶2刘月王琳1符文彬1

(广州中医药大学第二临床医学院，广东广州510405)

目的观察电针对CUMS大鼠前额皮层星形胶质细胞谷氨酰胺合成酶(GS)、EAAT1、EAAT2的影响。方法将56只雄性SD大鼠随机分为正常组、空白组、针刺组和药物组，每组14只。除正常组常规饲养外，空白组、针刺组和药物组大鼠予慢性不可预见性温和刺激建立抑郁模型。造模成功后，空白组单笼饲养、只给予相同程度的捉抓；针刺组单侧交替取太冲、合谷穴予连续波、2 Hz电针刺激，1次/d、30 min/次，连续治疗35 d；药物组予利鲁唑4 mg/kg灌胃，1次/d，连续给药35 d。用旷场实验和糖水偏好实验评价大鼠行为学，用Western印迹技术从蛋白水平观察前额皮层星形胶质细胞高亲和性兴奋性氨基酸转运体EAAT1、EAAT2蛋白以及GS的变化，应用RT-PCR技术从mRNA水平检测EAAT1 mRNA、EAAT2 mRNA、GS mRNA的变化。结果行为学药物组和电针组均能改善因CUMS造模导致的旷场实验的水平爬格、直立站立次数降低，治疗至第14天时可达正常水平(P>0.05)；糖水偏好率也于治疗第7天开始得到纠正(P>0.05)；电针组和药物组对行为学的改善程度相当(P>0.05)。行为学的改善与前额皮层GS、EAAT1、EAAT2和EAAT1 mRNA、EAAT2 mRNA、GS mRNA升高相对应。结论电针上调前额皮层星形胶质细胞高亲和性兴奋性氨基酸转运体EAAT1、EAAT2和GS表达，提高谷氨酸摄取功能，从而改善抑郁症状，可能是针刺抗抑郁的机制之一。

电针；抑郁；星形胶质细胞；EAAT1；EAAT2；GS

胶质细胞一直被认为是中枢神经系统中辅助神经元完成功能的次要结构，其与神经元的构成比例与物种和不同脑区相关〔1〕。然而，近年来研究者们发现胶质细胞与神经细胞相互作用、共同发起与维持神经活动，参与了诸多神经精神生理和病理活动〔2〕。胶质细胞成分还是许多神经精神疾病的病理基础〔3〕。星形胶质细胞(As)是脑内谷氨酸代谢主要途径——“谷氨酸能三重突触”结构的重要组成部分，通过EAAT1、EAAT2对细胞间隙兴奋性神经递质谷氨酸含量及谷氨酸/谷胺酰胺循环的动态调节与抑郁症发生密切相关〔4,5〕。针刺能有效降低抑郁症及其相关心境障碍患者的各项抑郁、焦虑量表评分，提高生活质量〔6〕，可能与针刺能有效纠正抑郁状态下中枢神经系统神经胶质细胞的异常超微结构、改善胶质细胞和神经细胞能量代谢相关〔7,8〕。然而，针刺启动As保护环节的内在确切机制尚不明确。本研究拟从As谷氨酸兴奋性转运体EAAT1、EAAT2谷氨酸摄取环节探讨电针抗抑郁的确切靶点，为针刺临床应用提供机制支持。

1　材料与方法

1.1动物与分组将广东省实验动物中心提供体重260～300 g的健康雄性SD大鼠56只，随机分为正常组、空白组、针刺组和药物组，每组10只。正常组大鼠常规饲养，空白组、针刺组和药物组采用慢性不可预见温和型刺激联合孤养造模。

1.2模型制备以7 d为1个周期，大鼠依次接受禁食、禁水、倾笼、晃尾、夹尾、冰水、昼夜颠倒、电击足底8种不同刺激，由弱到强、循环往复，共进行5个周期，时长35 d。完成造模后用行为学指标判断是否造模成功，造模成功的大鼠接受电针或药物干预。

1.3实验干预空白组和对照组大鼠均单笼饲养，不予任何处理，仅进行相同程度的捉抓；针刺组取交替单侧太冲、合谷予连续波、2 Hz电针刺激，以大鼠肢体微微抽动为度，1次/d、30 min/次，连续治疗35 d；药物组予利鲁唑4 mg/kg灌胃，1次/d，连续给药35 d。

1.4指标测量

1.4.1行为学检测旷场实验(OFT)：选用四周及底部均涂黑、规格为80 cm×80 cm×40 cm的无盖木箱，用白线将木箱底部划分为25个16 cm×16 cm的方格，沿墙格为外周格，其余为中央格。用摄像头记录大鼠放置在中央格后、3 min内的活动轨迹，分别记录水平穿越方格数和直立站立次数。

糖水偏好实验(SPT)：实验准备阶段，鼠笼中放置两个外形相同的动物水瓶，第1个和第2个24 h分别放置等重的1%蔗糖水和纯净水，随后禁食水24 h。实验阶段，同时给予1%蔗糖水和纯净水1瓶，24 h后测量糖水和纯净水的消耗量。

1.4.2高亲和性兴奋性氨基酸转运体EAAT1、EAAT2蛋白表达情况大鼠完成干预后腹腔麻醉处死，4℃多聚甲醛灌注后断头取脑、分离前额。冰上操作，称取10～100 mg组织加入组织裂解液0.5 ml剪碎匀浆，离心，提取总蛋白。采用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，PVDF 膜转膜，山羊抗兔IgG(H+L) HRP 1∶20 000抗体孵育，ECL显影发光。胶片感光、显影、定影后，用801成像系统测定条带的光密度、进行灰度值分析(GAPDH为内参)，谷氨酰胺合成酶(GS)、EAAT1、EAAT2的表达水平分别以GS、EAAT1、EAAT2/GAPDH表示。

1.4.3高亲和性兴奋性氨基酸转运体EAAT1、EAAT2基因mRNA转录水平情况用CWbio试剂盒提取各组样品的总RNA，用1%琼脂糖检测RNA完整性后，消化处理RNA中残留的DNA，完成反转录后用ABI荧光定量PCR仪进行定量，采用2-△△CT法进行相对定量分析。引物序列：EAAT1上游 5'-GCCATCATGAGATTGGTAGCGGT-3'，187 bp，下游5'- GGAAGTAGAGGAGAGGCAGGACGA-3'，187 bp;EAAT2上游5'- GAACTTCGGTCAATGTAGTGGGCG-3'，132 bp，下游5'- TGGACTGCGTCTTGGTCATTTCG-3'，132 bp；GS 上游5'-GCTGGTGTTATGTGAAGTTTTCAAG-3'，73 bp，下游5'-CCGTTTACAGGTGTGCCTCAA-3' ，73 bp；βactin上游 5'- GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，150 bp，下游5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3',150 bp。

1.5统计学方法采用SPSS18.0软件，计量资料服从正态分布组间比较采用方差分析，偏态分布比较采用非参数检验，多时点组间比较采用重复测量方差分析，不满足协方矩阵或球形检验采用矫正检验。

2　结　果

2.1旷场实验

2.1.1大鼠水平爬格数目CUMS造模使大鼠的水平爬格数均较正常组显著降低(P<0.05)，空白组、电针组和药物组间无差异(P>0.05)。治疗第7、14、21、35天，电针组和药物组大鼠水平爬格数均较空白组显著增加(P<0.05)，且抑郁模型大鼠随着时间的累积，爬格数逐渐升高，但电针组、药物组在治疗21、35 d时可与正常组大鼠爬格数相当(P>0.05)；电针组和药物组各时点均间无明显统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1　干预后大鼠水平爬格数目,个,n=14)

与正常组比较：1)P<0.05；与空白组比较：2)P<0.05；下表同

2.1.2大鼠垂直站立次数治疗前CUMS模型组大鼠大鼠垂直站立次数均显著下降(P<0.05)；治疗第7、14、21、35天，空白组大鼠垂直站立次数较正常组显著减少(P<0.05)，电针组、药物组较空白组显著增加(P<0.05)、较正常组无显著差异(P>0.05)；电针组和药物组各时点均间无明显统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2　干预后大鼠垂直站立次数,次,n=14)

2.2糖水偏好实验干预前，对照组、针刺组、药物组大鼠糖水偏好率组间无明显差异(P>0.05)。在干预第7、14、21、35天，电针组和药物组糖水偏好情况相对空白组有显著改善(P<0.05)；空白组、针刺组、药物组组间无明显差异(P>0.05)；治疗第14、21、35天，与正常组比较，各组间无明显差异(P>0.05)。见表3。

2.3前额皮层高亲和性兴奋性氨基酸转运体EAAT1、EAAT2蛋白表达前额皮层空白组GS显著低于正常组(P<0.05)，电针组和药物组GS表达均高于空白组(P<0.05)，与正常组无差异；各组间EAAT1、EAAT2表达趋势与GS相近，空白组大鼠均较其他组表达水平低(P<0.05)，电针组和药物组均高于空白组，而电针组和药物组之间无差异(P>0.05)。见图1、表4。

2.4前额皮层GS、EAAT1、EAAT2 mRNA表达空白组GS mRNA表达水平显著降低(P<0.05)，电针组和药物组GS均较空白组升高(P<0.05)；空白组、电针组和药物组的EAAT1表达均较正常组下降，电针组较空白组无差异，药物组较空白组、电针组表达升高(P<0.05)；空白组、电针组、药物组EAAT2均较正常组表达下调(P<0.05)。见表5。

1～8：每组8个样本图1　大鼠前额叶皮层GS 、EAAT1 、EAAT2蛋白含量

组别GSEAAT1EAAT2正常组0.62±0.270.56±0.370.62±0.27空白组0.34±0.180.28±0.190.34±0.18电针组0.52±0.171)2)0.45±0.081)2)0.52±0.172)药物组0.60±0.032)0.52±0.040.60±0.03

表5　前额皮层GS、EAAT1、EAAT2 mRNA表达

3　讨　论

As与神经元构成的神经元-胶质信号网络是脑内信息传递的主要途径，其中As参与构成的“谷氨酸能三重突触”结构是调节哺乳动物CNS中兴奋性神经递质谷氨酸的重要结构，由突触前神经元-胶质细胞-突触后神经元组成，是脑内谷氨酸循环和再利用的重要途径〔9〕。谷氨酸能神经元释放谷氨酸至突触间隙，通过突触后膜的离子型和代谢型谷氨酸受体转导冲动从而发挥生理作用；当谷氨酸水平积累过高，可触发负反馈调节，启动EAAT1、EAAT2和GS加大As对谷氨酸的重吸收，从加快突触传递、降低突触间谷氨酸含量两方面维持神经元突触功能稳定的重要作用〔10〕。GS在“谷氨酸-谷氨酰胺循环”中的主要功能是将As胞内的谷氨酸合成为谷氨酰胺，是谷氨酸分解代谢的重要环节，从GS功能的情况可以推断谷氨酸的代谢及“谷氨酸-谷氨酰胺循环”的情况。作为As上的高亲和兴奋性氨基酸转运体，EAAT1、EAAT2可摄取80%～90%突触前神经元释放的谷氨酸，将突触间隙的谷氨酸维持在较低浓度，避免发生兴奋性氨基酸毒性〔11〕。

无论是动物实验或是尸检研究，均证实抑郁大鼠或是患者的前额叶等脑区出现EAAT1和EAAT2的表达下调〔12,13〕。临床研究还表明，长期情绪应激损伤AS的兴奋性氨基酸转运功能，突触间隙谷氨酸逐渐累积进而诱发兴奋性氨基酸毒性〔13〕。故上调As的EAATs表达水平，加快谷氨酸代谢，有助于改善抑郁样症状。

目前针刺对星形胶质细胞的谷氨酸调节作用已在缺血性脑病实验研究〔14〕中得到证实，表明电针可调节大鼠星形胶质细胞的作用而改善症状，可以提高星形胶质细胞谷氨酸转运体EAAT1、EAAT2的表达，增强星形胶质细胞灭活谷氨酸的能力。本研究结果显示，电针可以上调前额皮层As高亲和性兴奋性氨基酸转运体EAAT1、EAAT2和GS表达，提高谷氨酸摄取功能，从而改善抑郁症状，这可能是针刺抗抑郁的机制之一。

1Rajkowska G,Miguel-Hidalgo JJ,Wei J,etal.Morphometric evidence for neuronal and glial prefrontal cell pathology in major depression〔J〕.Biol Psychiatry,1999;45(9):1085-98.

2Lee Y,Gaskins D,Anand A,etal.Glia mechanisms in mood regulation:a novel model of mood disorders〔J〕.Psychopharmacology (Berl),2007;191(1):55-65.

3Rajkowska G,Miguel-Hidalgo JJ.Gliogenesis and glial pathology in depression〔J〕.CNS Neurol Disord Drug Targets,2007;6(3):219-33.

4Lebon V,Petersen KF,Cline GW,etal.Astroglial contribution to brain energy metabolism in humans revealed by 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy:elucidation of the dominant pathway for neurotransmitter glutamate repletion and measurement of astrocytic oxidative metabolism〔J〕.J Neurosci,2002;22(5):1523-31.

5Schousboe A,Waagepetersen HS.Glial modulation of GABAergic and glutamatergic neurotransmission〔J〕.Curr Top Med Chem,2006;6(10):929-34.

6樊凌，符文彬，许能贵，等.疏肝调神针灸方案治疗抑郁症的随机对照研究〔J〕.中华中医药杂志,2012;31(4):841-6.

7姜硕，黄彬，樊凌，等.电针四关穴对抑郁大鼠海马星形胶质细胞形态的影响〔J〕.中华中医药杂志,2015;30(1):216-8.

8肖瑶，姜硕，符文彬，等.透射电镜下电针对慢性应激致抑郁大鼠海马AST结构和功能的影响〔J〕.中华中医药杂志,2014;33(5):1682-6.

9Machado-Vieira R,Manji HK,Zarate CA.The role of the tripartite glutamatergic synapse in the pathophysiology and therapeutics of mood disorders〔J〕.Neuroscientist,2009;15(5):525-39.

10Banasr M,Duman RS.Glial loss in the prefrontal cortex is sufficient to induce depressive-like behaviors〔J〕.Biol Psychiat,2008;64(10):863-70.

11Ozawa S.Role of glutamate transporters in excitatory synapses in cerebellar Purkinje cells〔J〕.Brain Nerve,2007;59(7):669-76.

12Miguel-Hidalgo JJ,Waltzer R,Whittom AA,etal.Glial and glutamatergic markers in depression,alcoholism,and their comorbidity〔J〕.J Affect Disord,2010;127(1-3):230-40.

13Banasr M,Chowdhury GM,Terwilliger R,etal.Glial pathology in an animal model of depression:reversal of stress-induced cellular,metabolic and behavioral deficits by the glutamate-modulating drug riluzole〔J〕.Mol Psychiatry,2010;15(5):501-11.

14罗燕，许能贵，易玮，等.电针对局灶性脑缺血大鼠缺血灶周围区星形胶质细胞谷氨酸转运体的影响〔J〕.安徽中医学院学报,2009;20(1):30-3.

〔2016-06-07修回〕

(编辑曲莉)

Effect of electric acupuncture on GS,EAAT1,EAAT2 of astrocyte cell in CUMS rats' prefrontal cortex

LUO Ding,ZHANG Xue-Chun,XIAO Yao,et al.

The Second Medical Collage of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510405,Guangdong,China

ObjectiveTo investigate the electric acupuncture effect on GS,EAAT1,EAAT2 of astrocyte cell in CUMS rats' prefrontal cortex.MethodsTotal 56 SD rats were randomly divided into normal,control,acupuncture and riluzole groups.Rats in control,acupuncture and Riluzole groups underwent CUMS.After finished CUMS,rats in control group were kept in single without any intervention.Rats in acupuncture group received continuous wave electric stimulating on LR3 and LI4 at frequency of 2 Hz once per day for 35 days.Rats in Riluzole group were given by gavage at dose of 4 mg/L once a day for 35 days.Open field test and sugar preference test were employed for behavior measure.Western blot and Rt-PCR were used for evaluating GS,EAAT1,EAAT2,EAAT1 mRNA,EAAT2 mRNA and GS mRNA expression.ResultsRats in control group showed decreased in lateral movement,stand upright of OFT and sugar preference.Both Riluzole and electric acupuncture could rectify the behavior after 7,14,21,35 days treatment.All of the remission of behavior defect may relevant to electric acupuncture effect on GS,EAAT1,EAAT2 of astrocyte cell in CUMS rats' prefrontal cortex.ConclusionsOne of the underlying mechanism of antidepressant effect of electric acupuncture may involve to its effect on GS,EAAT1,EAAT2 of astrocyte cell in CUMS rats' prefrontal cortex.

Electric acupuncture；Depression；Astrocyte；EAAT1；EAAT2；GS

国家自然科学基金(No.81173348)

符文彬(1963-)，男，博士，教授，主任医师，博士生导师，主要从事针灸治疗痛症及抑郁相关病症的研究。

罗丁(1985-)，女，博士，医师，主要从事针刺治疗抑郁相关病症的研究。

R74

A

1005-9202(2016)17-4143-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.003

1广东省中医院2广州医科大学