神经干细胞标志物nestin在成人Müller细胞中表达特征的初步研究△

张荣　章淑杰　陈君毅　何杰　吴继红



·基础研究·

神经干细胞标志物nestin在成人Müller细胞中表达特征的初步研究△

张荣章淑杰陈君毅＊何杰＊＊吴继红

目的研究神经干细胞标志物巢蛋白(nestin)在原位和体外培养成人Müller细胞中的表达特征。方法取正常成人眼球，制备冷冻切片，采用免疫荧光方法对谷氨酸合成酶(GS)和nestin进行双标检测；采用免疫荧光方法检测原代和传代培养的Müller细胞nestin表达；取原代培养的成人Müller细胞给予过氧化氢(H2O2)刺激，采用免疫荧光方法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和nestin的表达，并计数分析。结果在成人眼球切片中，原位成人Müller细胞GS免疫荧光染色阳性，但nestin染色阴性。原代培养的Müller细胞中检测到部分nestin阳性表达的细胞，10代以内细胞nestin阳性比例为(15.16%±5.07%)～(22.42%±4.6%)，且代次间无显著差异。H2O2刺激原代培养的Müller细胞后，GFAP阳性细胞数增加，是对照组的1.30～2.08倍，但nestin阳性细胞比例未见显著变化。结论正常成人Müller细胞原位时呈静息状态，不表达干细胞标志物nestin；体外培养条件可能作为一种刺激因素使部分Müller细胞离开静息状态呈现干细胞特性；人Müller细胞在体外传代及H2O2刺激后nestin阳性细胞数未见显著变化，提示并非全部Müller细胞均具有干细胞潜能，成人Müller细胞可能存在不同的亚型。(中国眼耳鼻喉科杂志，2016，16：305-308)

成人Müller细胞；巢蛋白；干细胞潜能；亚型

视网膜Müller细胞是哺乳动物视网膜内最主要的神经胶质细胞，占视网膜神经胶质细胞的90%以上。Müller细胞不仅在视网膜的病理生理方面起着重要作用，而且在视网膜受损后，还可以成为修复视网膜的干细胞来源[1-2]。成人Müller细胞被认为是视网膜中唯一具有干细胞潜能的一类神经细胞，并且Müller细胞在很多病理条件下可以被激活。然而，是否全部成人Müller细胞均具有干细胞潜能，尚未见报道。因此，本实验对比研究了成人Müller细胞在视网膜原位和体外原代培养及氧化损伤刺激后Müller干细胞特性表达的特征。

1　材料与方法

1.1材料DMEM/F12培养基：Thermo；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)：Thermo；谷氨酸合成酶(glutamine synthetase,GS)抗体：abcam，ab16802；波形蛋白(vimentin)抗体：abcam，ab8978；nestin抗体：abcam；胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体：cell signaling technology，12389；hoechst33258：Thermo，H3569；共聚焦荧光显微镜(SP8，Leica，德国)。

1.2方法

1.2.1成人Müller细胞在视网膜原位nestin的检测成人眼球经4%多聚甲醛固定，蔗糖脱水后，制成10 μm的冷冻切片；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)冲洗3次，每次3 min;0.1%Triton X-100 (PBS配制 )室温通透20 min；PBS冲洗玻片3次，每次3 min；3%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭30 min，吸弃BSA；无需冲洗，加GS(1∶200)和nestin(1∶200)混合一抗并放入湿盒，4 ℃孵育过夜。第2天，PBS冲洗3次，每次5 min；加488和555标记的混合荧光二抗，湿盒中置室温孵育1 h；PBS冲洗3次，每次5 min。hoechst染核，2～3 min；PBS冲洗3次，每次5 min；用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.2.2成人Müller细胞的原代培养和鉴定取离体6 h内、角膜移植后的眼杯，自锯齿缘后1～2 mm处环形剖开眼球，去除眼前部组织及玻璃体，留后半眼球壁于PBS中；轻轻剥离视网膜组织，将其放于含PBS的培养皿中进行漂洗，洗去组织上粘连的色素上皮，吸去PBS；将视网膜组织剪碎，加入5倍组织块体积的0.25%胰酶于细胞培养箱中消化；20 min后取出，加入等体积含15%FBS的DMEM/F12培养液，用移液器吹打至看不到明显组织，1 200转/min离心5 min，弃上清液；加入含15%FBS的DMEM/F12培养液制成细胞悬液接种于培养瓶中，置于恒温恒湿培养箱(37 ℃，体积分数5%CO2)中培养，待细胞生长近80%～90%汇合时，以1∶2方式传代。将Müller细胞接种于细胞爬片上，在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min；0.1%Triton X-100(PBS配制)室温通透20 min,PBS浸洗玻片3次，每次3 min；3%BSA室温封闭30 min，吸弃BSA，无需冲洗，加GS(1∶200)和vimentin(1∶200)一抗并放入湿盒，4 ℃孵育过夜。第2天，PBS冲洗3次，每次5 min；加488和555标记的荧光二抗，湿盒中室温孵育1 h；PBS冲洗3次，每次5 min；hoechst染核，2～3 min，PBS冲洗3次，每次5 min；用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

1.2.3成人Müller细胞传代培养后nestin的检测原代成人Müller细胞在体外传代培养到第10代，每一代都用免疫荧光方法双标GS和nestin。

1.2.4H2O2刺激成人Müller细胞后nestin表达的检测取第4代成人Müller细胞接种于24孔板，每孔接种104个细胞。分为对照组和H2O2处理组，其中H2O2处理组再依据浓度不同分为5个组，浓度分别为1、10、100、200、500 μmol/L。每组2孔，4 h后用免疫荧光方法检测GFAP和nestin的表达。

1.2.5细胞免疫荧光图像分析每个细胞爬片计数全部GFAP阳性细胞。每个细胞爬片任选3个视野，对nestin阳性细胞进行计数。

1.3统计学处理实验数据均以均数±标准差表示，应用SPSS统计软件进行单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1人视网膜冷冻切片免疫荧光结果成人Müller细胞在视网膜原位表达其特异性标志物GS，但nestin染色为阴性(图1)。

图1.　人视网膜冷冻切片GS和nestin免疫荧光染色　成人视网膜中Müller细胞GS表达阳性，nestin表达为阴性(×400)

2.2体外培养人视网膜Müller细胞形态和免疫荧光鉴定相差显微镜下观察原代人视网膜Müller细胞，胞体较大，呈双极形态(图2A)。融合后，细胞变得细长，呈成纤维细胞形态(图2B)。免疫荧光结果显示，绝大多数细胞表达Müller细胞特异性标志GS (图2C)和vimentin(图2D)。

图2.　人视网膜Müller细胞的形态和鉴定　A.原代人视网膜Müller细胞，胞体较大，呈双极形态(×100)；B.融合后，细胞变得细长，呈成纤维细胞形态(×100)；C，D.免疫荧光染色，绝大多数细胞表达Müller细胞特异性标志蛋白GS和vimentin(×200)

2.3部分原代培养的Müller细胞表达nestin免疫荧光检测发现部分原代培养的Müller细胞呈现GS与nestin共染(图3)。计数分析结果显示nestin阳性率在10代内稳定在(15.16%±5.07%)～(22.42%±4.6%)，且代次间差异无统计学意义(P>0.05)(图4)。

图3.　原代人Müller细胞GS和nestin免疫荧光染色部分原代培养的Müller细胞同时表达GS与nestin(×200)

图4.　体外培养成人Müller细胞p0-p10nestin阳性细胞比例　nestin阳性率在10代内稳定在(15.16%±5.07%)～(22.42%±4.6%)，且代次间差异无统计学意义(P>0.05)

2.4H2O2刺激体外培养成人Müller细胞结果500 μmol/L H2O2处理组细胞出现明显损伤死亡，大量细胞漂浮，其余各组GFAP阳性细胞数量是对照组的1.30～2.08倍，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)(图5)；但nestin阳性细胞未见显著变化(P>0.05)(图6)，阳性细胞稳定在(19.32%±1.49%)～(22.17%±5.69%)，且未观察到GFAP和nestin同时表达在相同细胞上(图7)。

图5.　H2O2刺激体外培养成人Müller细胞后GFAP阳性细胞数500 μmol/L H2O2处理组细胞出现明显损伤死亡，大量细胞漂浮，H2O2处理组GFAP阳性细胞数量与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)

图6.　H2O2刺激原代成人Müller细胞后nestin阳性细胞百分比变化各H2O2处理组较对照组nestin阳性细胞未见显著变化(P>0.05)，阳性细胞百分比稳定在(19.32%±1.49%)～(22.17%±5.69%)

图7.　H2O2刺激原代成人Müller细胞后GFAP和nestin的表达　H2O2刺激后未观察到GFAP和nestin同时表达在相同细胞中(×100)

3　讨论

视网膜Müller细胞是一种特殊的神经胶质细胞，在视网膜中发挥重要的生理作用。2001年Fischer等[3]首次提出Müller细胞可成为神经元再生的潜在资源后，Das等[4]进一步证实哺乳动物的Müller细胞具有神经源性多能干细胞潜能。近年的研究表明，人的视网膜Müller细胞经成纤维细胞生长因子2或维A酸刺激表现为干细胞分化的多能性[5]，并且人的视网膜Müller细胞能在体外诱导分化为神经节前体细胞和光感受器[6-7]。Müller细胞是神经元再生的安全、可靠潜在来源，因此研究成人Müller细胞的干细胞特性表达特征十分重要。

本文建立了原代成人Müller细胞系，该系在体外长期传代并能保持属性的稳定，表达Müller细胞特异性标记GS和vimentin。nestin是神经干细胞的重要标记，本实验结果表明Müller细胞在视网膜原位时不表达nestin，提示Müller细胞在正常视网膜中处于静息状态，不表现出干细胞的性质。而体外培养的原代Müller细胞除了表达GS和vimentin之外，部分Müller细胞同时表达神经干细胞标记nestin。因此，体外分离培养条件可能是一种刺激因素，使部分Müller细胞离开静息状态表现出干细胞特性。随着传代次数的增加，表达nestin的Müller细胞比例没有显著变化。H2O2产生的活性氧可以刺激Müller细胞激活，使其表达激活标记物GFAP。本实验中，Müller细胞激活后，GFAP显著增加，但nestin没有显著变化，并且被激活的细胞不同时表达nestin。以上实验结果说明了只有一定比例的Müller细胞可以被刺激而表现出干细胞特性，这群细胞可能是Müller细胞的一种亚型。

人的视网膜Müller细胞能在体外诱导分化为神经节前体细胞和光感受器，但是诱导分化效率并不是很高。本实验研究发现，人Müller细胞可能存在不同亚型，将具有干细胞特性的细胞分开培养，有利于我们更好地研究认识Müller细胞，也可能是提高Müller细胞分化效率的新方法。

[1]Nickerson PE，Da SN，Myers T，et al．Neural progenitor potential in cultured Müller glia：effects of passaging and exogenous growth factor exposure[J].Brain Res，2008，1230：1-12.

[2]Bemardos RL，Barthel LK，Meyers JR，et al．Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Müller glia that function as retinal stem cells[J].J Neurosci，2007,27(26)：7028-7040.

[3]Fischer DJ，Reh TA．Mailer glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina[J].Nat Neurosci，2001，4(3)：247-252.

[4]Das AV，Mallya KB，Zhao X，et al．Neural stem cell properties of Mailer glia in the mammalian retina：regulation by Notch andWnt signaling[J].Dev Biol，2006，299(1)：283-302．

[5]Lawrence JM，Singhal S，Bhatia B，et al．MIO-M1 cells and similar Müller glial cell lines derived from adult human retina exhibit neural stem cell characteristics[J].Stem Cells，2007，25(8)：2033-2043．

[6]Singhal S，Bhatia B， Jayaram H，et al．Human Müller glia with stem cell characteristics differentiate into Retinal ganglion cell (RGC) precursorsinvitroand partially restore RGC function in vivo following transplantation[J]. Stem Cells Transl Med，2012，1(3)：188-199.

[7]Giannelli SG，Demontis GC，Pertile G，et al．Adult human Müller glia cells are a highly ef cient source of rod photoreceptors[J]. Stem Cells，2011，29(2)：344-356.

(本文编辑诸静英)

Preliminary study on the expression of the neural stem cell marker nestin in human Müller cells

ZHANGRong,ZHANGShu-jie,CHENJun-yi＊,HEJie＊＊,WUJi-hong.

ResearchCenter,EyeEarNoseandTroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,China

WU Ji-hong， Email： jihongwu@fudan.edu.cn

ObjectiveTo study the stem cell properties of human retinal Müller cellsinsituandinvitro. MethodsThe expression of glutamate synthase (GS) and nestin in the crynosections of human eyes, the expression of nestin in the primary Müller cell culture, and the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and nestin with the treatment of H2O2were examined by using immunofluorescence staining. ResultsIn the human eye section, Müller cells were positive in GS but negative in nestin. In contrast, in the primary culture, nestin was expressed in a small set of Müller cells, which constituted from 15.16%±5.07% to 22.42%±4.6% of the total Müller cell population. And such proportion was invariable within ten generations.Upon H2O2treatment, the GFAP-positive cells increased while the nestin-expressing cell population remained unchanged. ConclusionsIn adult human eye, Müller cells were in the resting state and nestin was absent. However, soon after culturedinvitro, a subset of Müller cells started to express nestin, a maker for stem cells, suggesting that the culture condition probably facilitated a portion of the Müller cells to leave the resting state. Upon H2O2treatment, the number of the nestin-positive cells which potentially have the characteristics of stem cells did not change significantly, suggesting the existence of distinct subtypes of human Müller cells. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16: 305-308)

Human Müller cells；Nestin；Stem cell potential；Subtype

国家自然科学基金(81470624)；上海市卫生局局级科研项目(20124073)；上海市科委医学引导项目(134119a880)

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院实验中心＊眼科上海200031；＊＊中国科学院神经科学研究所上海200031

吴继红(Email: jihongwu@fudan.edu.cn)

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.05.001

2016-06-13)