4-酰氧基黄体酮衍生物的合成及其细胞毒性

范宁娟, 汤江江

(1. 西北农林科技大学 a. 生命科学学院； b. 理学院，陕西 杨凌　712100)



4-酰氧基黄体酮衍生物的合成及其细胞毒性

范宁娟1a, 汤江江1b*

(1. 西北农林科技大学 a. 生命科学学院； b. 理学院，陕西 杨凌712100)

以黄体酮为前体，经4,5-环氧黄体酮合成了4-羟基黄体酮(2); 2与酰氯经酰化反应合成了一系列新型4-酰氧基黄体酮衍生物(4a～4i)，其结构经1H NMR，13C NMR和MS(ESI)表征。体外细胞毒性实验结果表明：在用药量为50 μg·mL-1时， 4c， 4d和4e对MCF-7细胞的抑制率分别为26%， 22%和13%。

甾体; 黄体酮; 酰氧基; 细胞毒性; 合成

甾体类衍生物是有机合成中活性比较广泛的化合物，通常具有亲脂性，对细胞膜和某些甾体受体有较强的亲和力，受到了研究人员的广泛关注[1-2]。黄体酮是一种比较廉价的孕甾烷和常用的激素类药物，黄体酮衍生物通常具有广泛的生物活性[3-6]。有专利指出，4-羟基黄体酮的酯类具有治疗功能性子宫出血的功效[7-8]，但未提供此类衍生物详细的波谱数据，更未见其具体的药理学研究结果。

近年来本课题组以黄体酮为底物，设计并合成了多个系列的黄体酮类衍生物[9-12]。作为合成工作的延续，本文以黄体酮为前体，经4,5-环氧黄体酮(1)合成了4-羟基黄体酮(2)； 2与取代酰氯(3a～3i)经酰化反应合成了系列新型4-酰氧基黄体酮衍生物(4a～4i， Scheme 1)，其结构经1H NMR，13C NMR和MS(ESI)表征。考察了4的体外细胞毒性。

Scheme 1

1　实验部分

1.1仪器与试剂

XT-4型双目显微熔点仪(温度未校正)；Bruker Advance III 500型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；LTQ Fleet 型ESI源质谱仪。1按文献[7]方法合成；4-氯黄体酮(5) 按文献[9]方法合成;其余所用试剂均为分析纯。

1.2合成

(1) 2的合成

将1 2.57 g(7.8 mmol)溶于冰醋酸50 mL中，稍微加热使其溶解。于室温加入浓硫酸2.5 mL，搅拌3 min(黄色变成红色)，于室温反应24 h(期间伴随偶尔的震荡)。将反应液倒入冰水1 L中(析出白色固体)，抽滤，滤饼用水反复洗涤至无刺激气味，加入二氯甲烷150 mL，依次用饱和氯化钠溶液(40 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压除溶，残余物用甲醇重结晶得白色固体2 1.59 g,收率62%， m.p.225～227 ℃(m.p. 230～232 ℃[8])；1H NMRδ： 0.67(s, 3H, 18-H), 0.96～1.06(m, 2H), 1.18(s, 3H, 19-H), 1.25～2.08(m, 13H), 2.12(s, 3H, 21-H), 2.17～2.10(m, 1H), 2.49～2.55(m, 3H), 2.99～3.02(m, 1H), 6.09(s, 1H, 4-OH);13C NMRδ： 13.34, 17.13, 20.96, 22.88, 22.93, 24.41, 30.92, 31.50, 31.76, 34.69, 35.16, 37.77, 38.73, 43.92, 54.09, 56.16, 63.58, 139.68, 141.22, 193.51, 209.36； MS(ESI)m/z: 331{[M+H]+}。

(2) 4a～4i的合成通法

将2 33 mg(0.1 mmol)溶于干燥的吡啶中(1.5 mL)，冰浴冷却下加入3a～3i 0.14 mmol，于室温反应至终点(TLC检测)。减压浓缩得油状粗产物，经GF254薄层层析[展开剂：(石油醚/丙酮=3/1，V/V)]纯化得4a～4i。

4-(苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4a)：白色固体38 mg, 收率88%， m.p.138～140 ℃；1H NMRδ: 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.17～2.19(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.75～2.78(m, 1H), 7.47(m, 2H, ArH), 7.60(m, 1H, ArH), 8.12(d,J=7.5 Hz, 2H, ArH)；13C NMRδ: 13.35, 17.74, 21.02, 21.02, 22.87, 24.18, 24.33, 30.92, 31.50, 33.49, 35.12, 38.66, 39.22, 43.91, 53.68, 55.96, 63.48, 126.29, 128.49, 129.08, 130.23, 133.49, 139.31, 164.43, 190.62, 209.26； MS(ESI)m/z: 435 {[M+H]+}。

4-(2′-氯苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4b)： 白色固体38 mg, 收率81%， m.p.205～207 ℃；1H NMRδ: 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.17～2.19(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.82～2.85(m, 1H), 7.35(m, 1H, ArH), 7.48(m, 2H, ArH), 8.07(dd,J=1.0 Hz, 8.5 Hz, 1H, ArH)；13C NMRδ: 13.36, 17.73, 21.02, 21.02, 22.87, 24.34, 24.34, 30.87, 31.52, 33.45, 35.11, 38.65, 39.29, 43.92, 53.67, 55.93, 63.48, 126.70, 128.93, 131.14, 132.24, 133.08, 134.27, 139.14, 156.30, 163.17, 190.30, 209.35； MS(ESI)m/z: 469{[M+H]+}。

4-(2′,4′-二氯苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4c)： 白色固体44 mg, 收率88%， m.p.183～185 ℃;1H NMRδ： 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.17～2.20(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.77～2.80(m, 1H), 7.34(dd,J=2.0 Hz, 8.5 Hz, 1H, ArH), 7.51(d,J=2.0 Hz, 1H, ArH), 8.03(d,J=8.5 Hz, 1H, ArH)；13C NMRδ：13.35, 17.73, 21.01, 21.01, 22.87, 24.33, 24.33, 30.87, 31.52, 33.40, 35.09, 38.63, 39.30, 43.90, 53.65, 55.91, 63.46, 127.14, 127.19, 131.08, 133.29, 135.48, 138.93, 139.07, 156.39, 162.32, 190.17, 209.28; MS(ESI)m/z: 503{[M+H]+}。

4-(3′,5′-二氯苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4d)： 白色固体43 mg, 收率86%， m.p.145～146 ℃；1H NMRδ: 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.18～2.20(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.70～2.73(m, 1H), 7.58(t,J=2.0 Hz, 1H, ArH), 7.98(d,J=2.0 Hz, 2H, ArH)；13C NMRδ: 13.35, 17.75, 21.02, 21.02, 22.87, 24.33, 24.33, 30.90, 31.52, 33.38, 35.08, 38.62, 39.30, 43.90, 53.65, 55.91, 63.46, 128.60, 131.90, 133.31, 135.43, 139.13, 156.44, 162.16, 190.02, 209.28； MS(ESI)m/z: 503{ [M+H]+}。

4-(2′-溴苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4e)： 白色固体41 mg, 收率80 %， m.p. 214～216 ℃；1H NMRδ: 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.18～2.20(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.83～2.86(m, 1H), 7.40(m, 2H, ArH), 7.69(dd,J=0.5 Hz, 8.5 Hz, 1H, ArH), 8.06(dd,J=1.5 Hz, 7.5 Hz, 1H, ArH)；13C NMRδ: 13.36, 17.73, 21.01, 21.01, 22.87, 24.34, 24.34, 30.87, 31.52, 33.44, 35.11, 38.65, 39.30, 43.91, 53.67, 55.92, 63.48, 122.18, 127.28, 130.99, 132.20, 133.06, 134.41, 139.11, 156.34, 163.66, 190.27, 209.31； MS(ESI)m/z: 513{ [M+H]+}。

4-(4′-溴苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4f)： 白色固体43mg, 收率84%， m.p.179～181 ℃；1H NMRδ: 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.18～2.20(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.71～2.74(m, 1H), 7.61(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 7.97(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH)；13C NMRδ: 13.36, 17.75, 21.01, 21.01, 22.87, 24.33, 24.33, 30.91, 31.52, 33.44, 35.10, 38.64, 39.25, 43.91, 53.66, 55.94, 63.47, 127.99, 128.72, 131.72, 131.87, 139.21, 156.30, 163.75, 190.59, 209.27； MS(ESI)m/z: 513{ [M+H]+}。

4-(2′-碘苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4g)： 白色固体49 mg, 收率88%， m.p.217～219 ℃；1H NMRδ: 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(3s, H, 21-H), 2.18～2.20(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.82～2.85(m, 1H), 7.19(m, 1H, ArH), 7.44(t,J=7.5 Hz, 1H, ArH), 8.02(d,J=8.0 Hz, 1H, ArH), 8.08(dd,J=0.5 Hz, 7.5 Hz, 1H, ArH)；13C NMRδ: 13.36, 17.73, 21.01, 21.01, 22.87, 24.35, 24.35, 30.88, 31.52, 33.44, 35.12, 38.65, 39.30, 43.91, 53.65, 55.92, 63.48, 94.64, 128.02, 131.86, 133.13, 133.84, 139.11, 141.43, 156.32, 164.11, 190.27, 209.30； MS(ESI)m/z: 561{ [M+H]+}。

4-(4′-甲氧基苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4h)： 白色固体35 mg, 收率76%， m.p. 178～180 ℃；1H NMRδ: 0.67(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.29(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.18～2.20(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.74～2.77(m, 1H), 3.87(s, 3H, OCH3), 6.94(d,J=8.0 Hz, 2H, ArH), 8.07(d,J=7.5 Hz, 2H, ArH)；13C NMRδ: 13.35, 17.72, 21.01, 21.01, 22.84, 24.16, 24.32, 30.92, 31.51, 33.51, 35.11, 38.65, 39.18, 43.90, 53.66, 55.51, 55.95, 63.47, 113.77, 121.37, 132.33, 139.30, 156.12, 163.84, 164.13, 190.77, 209.29； MS(ESI)m/z: 465{ [M+H]+}。

4-(3′,4′-二甲氧基苯甲酰氧基)-孕甾-4-烯-3,20-二酮(4i)： 白色固体36 mg, 收率73%， m.p.79～80 ℃;1H NMRδ: 0.68(s, 3H, 18-H), 1.02～1.28(m, 5H), 1.30(s, 3H, 19-H), 1.46～2.10(m, 11H), 2.13(s, 3H, 21-H), 2.18～2.20(m, 1H), 2.53～2.56(m, 2H), 2.75～2.78(m, 1H), 3.93(s, 3H, OCH3), 3.95(s, 3H, OCH3), 6.92(d,J=8.5 Hz, 1H, ArH), 7.60(s, 1H, ArH), 7.79(d,J=8.0 Hz, 1H, ArH)；13C NMRδ: 13.36, 17.75, 21.03, 21.03, 22.87, 24.34, 24.34, 30.94, 31.51, 33.50, 35.13, 38.67, 39.22, 43.92, 53.69, 55.98, 56.03, 56.10, 63.49, 110.37, 112.49, 121.43, 124.49, 124.56, 139.34, 148.73, 153.53, 164.26, 190.69, 209.30； MS(ESI)m/z： 495{ [M+H]+}。

(3) 由5 合成 2

氮气保护条件下，将5 348 mg(1 mmol)溶于叔丁醇(25 mL)中，搅拌下加入氢氧化钾细粉末168 mg(3 mmol)，回流反应40 min。冷却至室温，加水30 mL，用乙酸乙酯(3×30 mL)抽提，合并有机相，用水洗涤，用无水硫酸钠干燥，减压除溶得粗产物，经薄层层析(展开剂：V(石油醚) ∶V(丙酮)=5 ∶1)纯化得2 276 mg，收率23%。

1.3体外细胞毒活性测试

用四氮唑蓝 (MTT)法测试了4a～4i的体外抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖的活性。以完全培养基为溶剂，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)作为对照药剂，将4a～4i配制成浓度为50 μg·mL-1的药液。将生长至对数生长期的细胞消化、离心, 制成细胞悬液, 吹匀并将其密度调至4～6×104个· mL-1, 以180 μL/孔接种到96孔板中, 将96孔板置于37 ℃含5% CO2的饱和湿度培养箱中孵育24 h。加入不同的受试化合物，每组设定4复孔，继续培养48 h。加入配制好的MTT溶液, 每孔20 μL，放入培养箱中继续孵育4 h。取出孵育4 h的96孔板, 将其中的MTT溶液轻轻甩出, 每孔加DMSO 100 μL，微量振荡仪上振荡5 min使甲瓒完全溶解, 用酶标仪在492 nm下测光密度(OD)值, 并记录数据，根据比值计算抑制率。

2　结果与讨论

2.1合成

黄体酮在碱性过氧化氢介质中生成1[9]， 1在酸性介质(浓硫酸和冰醋酸的混合液、冰醋酸和醋酸酐的混合液、冰醋酸和对甲苯磺酸的混合液以及对甲苯磺酸和甲酸混合液)中均能生成中间产物4,5-二羟基黄体酮，5-位的羟基脱水进而生成2。文献[13]报道1和甲酸反应合成2的收率不到40%，本文使用浓硫酸和冰醋酸的混合液进行脱水反应，于室温条件下缓慢分批加入混合液，避免浓硫酸产生热量而产生副反应，收率可达62%，比传统方法提高了20%。

另有报道[14]称4-氯甾体化合物可以在固体氢氧化钾的作用下直接转化为相应的4-羟基甾体化合物。我们用前期合成的5尝试了这种由氯代产物转化为羟基取代的反应，发现5可以直接转化为2(Scheme 2)，但收率很低(23%)。

Scheme 2

羟基是一种活性较强的反应基团，很容易和酰氯反应生成酰氧类产物。我们用吡啶作为反应介质和缚酸剂，使2发生酰化反应生成4a～4i，收率为73%～88%。理论上来说，酰氧类衍生物4a～4i的极性应该小于它的底物2，但TLC薄层层析分析结果恰恰相反，产物点在底端，底物点在高端，原因可能是2中3-位的羰基和4-位的羟基形成了分子内氢键，从而降低了分子本身的极性。

表1　4a～4i在50 μg·mL-1时抑制MCF-7细胞增殖的活性*

*NA 表示抑制率低于10%。

2.2体外细胞毒活性

本课题组前期合成的多个系列的黄体酮类衍生物均具有细胞毒活性[9～11]，因此本文采用常规的MTT比色实验, 测试了4a～4i对MCF-7的体外细胞毒抑制活性, 实验结果见表1。由表1可见，在浓度为50 μg·mL-1时，大多数4-酰氧基黄体酮类衍生物的抑制率均低于10%， 4c， 4d和4e对MCF-7细胞的抑制率分别为26%， 22%和13%，但抑制活性远逊于阳性对照5-fluorouracil(抑制率达95%)。

以黄体酮为原料，经4,5-环氧化后，在浓硫酸和冰醋酸混合液的条件下，得到了较高收率的关键中间体4-羟基黄体酮(2); 2通过酰化反应进一步得到了新型的4-酰氧基黄体酮衍生物，然而这些衍生物的体外细胞毒性并不强，其结构还有待于进一步优化。

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Synthesis and Cytotoxicity of 4-Acyloxy Modified Derivatives from Progesterone

FAN Ning-juan1a,TANG Jiang-jiang1b

(a. College of Life Science; b. College of Science, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China)

The 4-hydroxyprogesterone(2) was prepared from 4,5-epoxy progesterone， using progesterone as raw material. A series of novel 4-acyloxy progesterones(4a～4i) were synthesized by acetylation reaction of 2 with different acyl chlorides(3a～3i). The structures were characterized by1H NMR,13C NMR and MS(ESI). Theinvitrocytotoxicity results showed that 4c, 4d and 4e exhibited weak activity against the MCF-7 cells at the concentrations of 50 mg·mL-1, with inhibition rate of 26%, 22% and 13%, respectively.

steroid; progesterone; acyloxy; cytotoxicity； synthesis

2016-06-27

国家自然科学基金资助项目(21402156)

范宁娟(1980-)，女，汉族，陕西岐山人，博士，主要从事天然有机合成研究。

汤江江，副教授， Tel. 029-87092226, E-mail： tangjiang11@nwsuaf.edu.cn

O629； O621.3

ADOI： 10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.09.16162