伊马替尼衍生物的合成及其抗肿瘤活性

严晓阳, 郑绍成, 应礼彪

(1. 浙江师范大学 行知学院，浙江 金华　321004； 2. 金华市环境科学研究院，浙江 金华　321017)



伊马替尼衍生物的合成及其抗肿瘤活性

严晓阳1, 郑绍成1, 应礼彪2*

(1. 浙江师范大学 行知学院，浙江 金华321004； 2. 金华市环境科学研究院，浙江 金华321017)

以4-硝基-2-氨基甲苯为起始原料，经加成、缩合、环化和还原反应制得中间体N-(2-甲基-5-氨基苯基)-4-(3-吡啶基)嘧啶-2-胺(4)，再与取代酰氯反应，合成了7个新型伊马替尼衍生物(5a～5g)，其结构经1H NMR,13C NMR和HR-MS 表征。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法考察了5对人肝癌细胞(HepG-2)、子宫颈癌细胞(Hela)、肺癌细胞(H460)和乳腺癌细胞(MCF-7)体外抑制活性。结果显示：5e体外抑制活性最优，其IC50分别为10.90±1.00 μmol·L-1； 8.51±0.90 μmol·L-1； 13.15±1.11 μmol·L-1； 14.75±0.78 μmol·L-1。

4-硝基-2-氨基甲苯; 伊马替尼衍生物; 合成; 四甲基偶氮唑盐; 抗肿瘤活性

恶性肿瘤，又称癌症，是严重危害人类生命健康的疾病。2008年世界卫生组织(WHO)发布的《世界癌症报告》在2008年世界范围内有1200万人被确诊患有癌症，其中还有760万人因癌症而死亡，而这死亡人数却占到了全球死亡人数的13%，癌症的死亡人数预计全球范围内还会继续增加，癌症如果不加以干预，到2030年将有1200万人因癌症而死亡，在低收入或中等收入的国家死亡人数占70%[1-3]。设计合成高效的抗肿瘤药物和改造已有化学药物是目前化学药物研发的热点。

Scheme 1

甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesilate)，化学名为4-[(4-甲基-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-{[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基}苯基-苯胺甲磺酸盐，由瑞士诺华(Novartis) 公司开发，于2001 年获得美国食品药物管理局(FDA)批准上市[4-5]。伊马替尼可靶向3种酪氨酸激酶受体:C-kit(原癌基因蛋白)、BCR-ABL(癌基因产物)和PDGF(血小板衍生生长因子)受体[6-7]，因此也广泛应用于其他受体有关的肿瘤疾病的治疗。目前甲磺酸伊马替尼在治疗慢性髓细胞白血病上取得了显著的疗效，但是随着临床上的应用，其耐药性和不良反应(如恶心、呕吐、水肿、皮疹、骨关节及肌肉疼痛、中性粒细胞及血小板减少等)[8-10]相继出现。因此设计合成伊马替尼衍生物并考察其生物活性具有重要意义[11]。

本文参考文献[12-13]方法，以2-甲基-5-硝基苯胺(1)为起始原料,经加成、缩合、环化和还原反应得重要中间体伊马替胺(4)，再与取代酰氯反应合成了7个新型伊马替尼衍生物(5a～5g)(Scheme 1)。并对5进行人肝癌细(HepG2)[13]、子宫颈癌细胞(Hela)、肺癌细胞(H460)和乳腺癌细胞(MCF-7)体外抑制活性测试。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

RY-2型熔点仪(温度未校正)；Varian-Mercury 600型超导核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS 为内标)；Thermo Scientific Q Exactive型高分辨质谱仪。

所用试剂均为分析纯。

1.2合成

(1) 2-甲基-5-硝基苯胍(2) 的合成

在干燥的反应瓶中依次加入1 40.0 g(0.26 mol)、单腈胺22.0 g(0.55 mol)和乙醇150 mL，搅拌下滴加浓盐酸29 mL，滴毕，回流反应15 h。反应液减压除溶后加入水，于-5～0 ℃滴加硝酸铵的水溶液150 mL(30%)，滴毕，保温反应1～2 h。过滤，滤饼用乙醚洗涤，干燥得白色固体2 55 g, m.p.222～224 ℃。

(2)N-(2-甲基-5-硝基苯基)-4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-胺(3)的合成

将2 45.0 g ( 0.18 mol )和3-二甲氨基-1-(3-吡啶基)-2-丙烯-1-酮30.7 g( 0.18 mol)溶于异丙醇(200 mL)中，搅拌下加入NaOH 7.7 g(0.20 mol)，回流反应12 h。冷却至室温(析出固体)，抽滤，滤饼依次用异丙醇(200 mL)和水(100 mL)洗涤，甲醇重结晶得黄色固体3 46.0 g，收率87%，m.p.195～198 ℃[14]。

(3) 4的合成

在三口瓶中依次加入3 3.3 g(0.01 mol)， DMF 5 mL， 甲醇100 mL和钯碳0.3 g，通氢气，于室温反应至终点。抽滤，滤液蒸干甲醇得粗品，用二氯甲烷重结晶得黄色固体4 2.66 g。收率96%；1H NMRδ: 9.24(d,J=1.83 Hz, 1H), 8.69(dd,J=1.65 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.68(s, 1H), 8.46(d,J=5.13 Hz, 1H), 8.41(td,J=1.88 Hz, 7.98 Hz, 1H), 7.54(dd,J=4.77 Hz, 7.89 Hz, 1H), 7.36(d,J=5.14 Hz, 1H), 6.87(d,J=8.07 Hz, 1H), 6.79(d,J=2.20 Hz, 1H), 6.34(dd,J=2.20 Hz, 8.07 Hz, 1H), 4.85(s, 2H), 2.06(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 161.9, 161.7, 159.8, 151.8, 148.5, 147.2, 138.4, 134.8, 132.8, 130.8, 124.3, 119.8, 111.6, 111.4, 107.5, 17.7; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H16N5{[M+H]+}278.140 0, found 278.140 0。

(4) 5a～5g的合成通法

在反应瓶中加入4 0.276 g (1 mmol)和二氯甲烷10 mL，搅拌下于室温加入取代酰氯 1 mmol和三乙胺 1 mmol。反应至终点(TLC 跟踪)(展开剂: A=V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/2)。反应液浓缩后经硅胶柱层析(洗脱剂:A=1/10)纯化得5a～5g。

5a: 白色固体，收率82%；1H NMRδ: 10.22(s, 1H), 9.36～9.20(m, 1H), 8.98(s, 1H), 8.69(dd,J=1.65 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.51(d,J=5.13 Hz, 1H), 8.48(td,J=1.95 Hz, 8.02 Hz, 1H), 8.10(d,J=1.83 Hz, 1H), 7.99～7.92(m, 2H), 7.60～7.57(m, 1H), 7.54(s, 1H), 7.54～7.52(m, 1H), 7.52～7.51(m, 1H), 7.49(dd,J=2.11 Hz, 8.16 Hz, 1H), 7.43(d,J=5.13 Hz, 1H), 7.22(d,J=8.25 Hz, 1H), 2.23(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 165.9, 162.1, 161.6, 160.0, 151.8, 148.6, 138.3, 137.6, 135.5, 134.9, 132.7, 131.9, 130.5, 128.8, 128.1, 128.1, 124.3, 117.7, 117.2, 108.0, 18.1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C23H20N5O{[M+H]+}382.166 2, found 382.166 0。

5b: 白色固体，收率81.%;1H NMRδ: 10.11(s, 1H), 9.32(d,J=1.83 Hz, 1H), 9.01(s, 1H), 8.72(dd,J=1.65 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.55(d,J=5.14 Hz, 1H), 8.52(td,J=1.95 Hz, 8.02 Hz, 1H), 8.12(d,J=1.65 Hz, 1H), 8.02～7.97(m, 2H), 7.58～7.54(m, 1H), 7.52(dd,J=2.20 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.46(d,J=5.13 Hz, 1H), 7.24(d,J=8.44 Hz, 1H), 7.13～7.05(m, 2H), 3.87(s, 3H), 2.27(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 165.3, 162.3, 162.1, 161.6, 160.0, 151.8, 148.6, 138.2, 137.8, 134.9, 132.7, 130.5, 130.0, 127.9, 127.5, 124.3, 117.7, 117.2, 114.0, 108.0, 55.9, 18.1； HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C24H22N5O2{[M+H]+}412.176 8, found 412.176 6。

5c: 白色固体，收率78.9%；1H NMRδ: 9.79(s, 1H), 9.26(d,J=1.65 Hz, 1H), 8.92(s, 1H), 8.69(dd,J=1.47 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.50(d,J=5.13 Hz, 1H), 8.46(td,J=1.88 Hz, 7.98 Hz, 1H), 7.90(d,J=1.47 Hz, 1H), 7.55～7.47(m, 1H), 7.42(d,J=5.14 Hz, 1H), 7.28(dd,J=2.02 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.13(d,J=8.25 Hz, 1H), 2.28(t,J=7.43 Hz, 2H), 2.19(s, 3H), 1.58(t,J=7.15 Hz, 2H), 1.38～1.19(m, 8H), 0.85(t,J=6.97 Hz, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 171.5, 162.0, 161.6, 159.9, 151.8, 148.7, 138.2, 137.8, 134.9, 132.7, 130.5, 127.2, 124.2, 116.4, 115.9, 108.0, 40.5, 36.9, 31.6, 29.1, 29.0, 25.7, 22.5, 18.0, 14.4; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C24H30N5O{[M+H]+}404.244 5, found 404.244 4。

5d: 白色固体，收率85.6 %；1H NMRδ: 10.13(s, 1H), 9.30(d,J=1.65 Hz, 1H), 9.00(s, 1H), 8.70(dd,J=1.47 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.57～8.43(m, 2H), 8.10(d,J=1.28 Hz, 1H), 7.88(d,J=8.25 Hz, 2H), 7.55(dd,J=4.77 Hz, 7.89 Hz, 1H), 7.49(dd,J=2.02 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.44(d,J=5.14 Hz, 1H), 7.33(d,J=8.07 Hz, 2H), 7.21(d,J=8.25 Hz, 1H), 2.39(s, 3H), 2.23(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 164.7, 162.1, 161.6, 160.0, 151.9, 148.7, 138.3, 137.4, 136.8, 134.9, 134.2, 132.7, 130.6, 130.1, 129.0, 128.5, 125.3, 117.7, 117.2, 108.0, 19.0, 18.1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C24H22N5O{[M+H]+}396.181 9, found 396.181 9。

5e: 白色固体，收率80.6%；1H NMRδ: 10.48(s, 1H), 9.35(d,J=1.83 Hz, 1H), 9.10(s, 1H), 8.80(dd,J=1.28 Hz, 4.95 Hz, 1H), 8.72(d,J=8.07 Hz, 1H), 8.57(d,J=4.95 Hz, 1H), 8.09(s, 1H), 7.72(dd,J=5.04 Hz, 7.98 Hz, 1H), 7.59(dd,J=1.56 Hz, 7.43 Hz, 1H), 7.57(d,J=8.07 Hz, 1H), 7.51～7.49(m, 2H), 7.48～7.45(m, 1H), 7.40(dd,J=1.83 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.22(d,J=8.25 Hz, 1H), 2.23(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 165.3, 161.4, 161.1, 160.1, 149.4, 146.4, 138.2, 137.6, 137.6, 137.4, 133.7, 131.5, 130.7, 130.4, 130.1, 129.4, 128.2, 127.7, 125.3, 116.8, 116.5, 108.2, 18.1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C23H19N5OCl{[M+H]+}416.127 3, found 416.127 4。

5f: 白色固体，收率82.5%；1H NMRδ: 10.28(s, 1H), 9.28(d,J=2.20 Hz, 1H), 8.99(s, 1H), 8.69(dd,J=1.65 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.52(d,J=5.13 Hz, 1H), 8.48(td,J=1.97 Hz, 7.98 Hz, 1H), 8.09(d,J=1.65 Hz, 1H), 7.99(d,J=8.62 Hz, 2H), 7.64～7.59(m, 2H), 7.52(dd,J=4.77 Hz, 7.89 Hz, 1H), 7.48(dd,J=2.02 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.44(d,J=5.13 Hz, 1H), 7.22(d,J=8.25 Hz, 1H), 2.23(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ: 164.7, 162.1, 161.6, 160.0, 151.9, 148.7, 138.3, 137.4, 136.8, 134.9, 134.2, 132.7, 130.6, 130.1, 128.9, 128.3, 124.3, 117.7, 117.2, 108.0, 18.1; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C23H20N5OCl{[M+H]+}416.127 3, found 416.127 4。

5g: 白色固体，收率80.6%；1H NMRδ: 9.93(s, 1H), 9.26(d,J=2.02 Hz, 1H), 8.91(s, 1H), 8.70(dd,J=1.47 Hz, 4.77 Hz, 1H), 8.50(d,J=5.13 Hz, 1H), 8.47(td,J=1.77 Hz, 8.02 Hz, 1H), 7.90(s, 1H), 7.53(dd,J=4.77 Hz, 7.89 Hz, 1H), 7.42(d,J=5.14 Hz, 1H), 7.27(dd,J=1.83 Hz, 8.25 Hz, 1H), 7.14(d,J=8.25 Hz, 1H), 3.59(s, 3H), 2.61(s, 4H), 2.19(s, 3H);13C NMR(150 MHz)δ： 173.4, 170.0, 162.1, 161.6, 159.9, 151.8, 148.6, 138.3, 137.7, 134.9, 132.7, 130.6, 127.2, 124.3, 116.2, 115.7, 108.0, 51.8, 31.3, 29.0, 18.0; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C21H22N5O3{[M+H]+}392.171 7, found 392.171 8。

1.3抗肿瘤细胞毒活性实验

采用MTT法[15]测定了5a～5g对HepG2， Hela， H460和MCF-7四种肿瘤细胞的体外抗肿瘤活性[16]。

(1) 待测样制备

将状态良好的贴壁细胞(HepG2， Hela， H460， MCF-7)胰酶消化重悬计数，接种于96孔板，每孔细胞数目约104个，CO2培养箱中继续培养过夜，待细胞贴壁后每孔中加入含不同浓度化合物的无血清培养基(每个浓度设四个复孔，以不加细胞的孔读数时作空白，加细胞不加化合物的孔作对照孔，作实验阳性对照)。

(2) 测定方法

将新配的5a～5g的二甲亚砜溶液加入孔中，终浓度分别为5 μmol·L-1，10 μmol·L-1， 20 μmol·L-1， 40 μmol·L-1和80 μmol·L-1。静置48 h，每孔加入5 mg·ml-1MTT 10 uL ,继续培养4 h，弃去孔中培养基，每孔加入DMSO 150 uL，酶标仪上于490 nm处测定吸光度值，通过比较对照孔和化合物孔的读数，分别计算细胞生长抑制率。{抑制率=[(阴性对照组OD值-受试物组OD值) /阴性对照组OD值]×100%}，计算不同浓度下的抑制率，再以此求出各样品的IC50值。

2　结果与讨论

2.1合成

合成3时，我们采用了异丙醇做反应的溶剂，提高了反应温度，缩短了反应时间。

合成4时，采用钯碳做催化剂还原硝基，比传统的铁粉还原后处理简单，副产物少，可以直接用于下一步反应。

2.2抗肿瘤活性

表1为5的抗肿瘤活性。由表1可见，5对HepG2， Hela， H460和MCF-7 四种肿瘤细胞有一定的抑制作用。其中5e的细胞毒抑制活性最大。其IC50分别为10.90 μmol·L-1， 8.51 μmol·L-1， 13.15 μmol·L-1和14.75 μmol·L-1。

表1　5a～5g的体外抗肿瘤抑制活性

3　结论

合成了7个新型伊马替尼衍生物(5a～5g)，采用MTT法研究了5对HepG2， Hela， H460和MCF-7四种肿瘤细胞的体外抗肿瘤活性。结果表明：2-氯-N-{4-甲基-3-[4-(吡啶-3-基)吡啶-2-基氨基]苯基}苯甲酰胺(5e)的细胞毒抑制活性最大。发现芳环上带吸电子基团氯取代的芳香类伊马替尼衍生物的抑制活性较高。为今后研究该类化合物结构与活性的关系提供了一定的依据，进一步的结构优化与生物活性研究正在进行中。

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Synthesis and Antitumor Activities of Imatinib Derivatives

YAN Xiao-yang1,ZHENG Shao-cheng1,YING Li-biao2*

(1. College of Xingzhi, Zhejiang Normal University， Jinhua 321004， China; 2. Jinhua City Environmental Science Research Institute， Jinhua 321017， China)

Seven derivatives of imatinib(5a～5g)were prepared by condensation of substituted acid chlorides withN-(5-amino-2-methylphenyl)-4-(3-pyridyl)-2-pyrimidine amine, which was prepared from 2-methyl-5-nitroaniline through the reactions of addition, condensation, cyclization and reduction, respectively. The structures were characterized by1H NMR,13C NMR and HR-MS. Theinvitroantitumor activities of 5a～5g against human hepatoma cells(HepG2), cervical cancer cells(Hela), lung cancer cells (H460) and breast cancer cells(MCF-7) were investgated by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method. The results demonstrated that 5e exhibited good inhibition activities with IC50of 10.90±1.00 μmol·L-1, 8.51±0.90 μmol·L-1, 13.15±1.11 μmol·L-1and 14.75±0.78 μmol·L-1, respectively.

4-nitro-2-amino toluene; imatinib derivative; synthesis; MTT; anti-tumor activity

2016-07-15

严晓阳(1976-)，男，汉族，浙江东阳人，硕士研究生，主要从事精细有机合成和药物化学的研究。 E-mail: eastmorningsun@163.com

应礼彪，工程师， E-mail: jinhuayinggong@163.com

O625.6； O626.1

ADOI： 10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.09.16146