子宫颈腺癌高危型人乳头状瘤病毒P16INK4A蛋白表达情况

王伟源　肖小琴　程文德　林梅英

子宫颈腺癌高危型人乳头状瘤病毒P16INK4A蛋白表达情况

王伟源肖小琴程文德林梅英

目的 分析子宫颈腺癌癌变过程中高危型人乳头状瘤病毒（HR-HPV）感染检测及P16INK4A蛋白表达的临床意义。方法 2013年1月至2015年1月子宫颈微腺体增生患者25例、子宫颈原位腺癌患者65例、子宫颈浸润性腺癌患者24例，以及同期进行健康体检的慢性宫颈炎组织患者35例为观察对象。采用免疫组织化学方法检查组织中p16INK4A蛋白表达情况，并应用第二代杂交捕获法（HC-2）对13种HRHPV DNA进行检测。结果 子宫颈微腺体增生组织、原位腺癌及浸润性腺癌HR-HPV感染阳性率和P16INK4A蛋白表达阳性率均高于慢性宫颈炎组织（P＜0.05）；宫颈组织中HR-HPV感染阳性率与P16INK4A蛋白表达表现为正相关性（P＜0.05）。结论 HR-HPV导致宫颈恶化转化与P16INK4A蛋白表达密切相关，可以作为诊断子宫颈腺癌的辅助诊断指标，采用P16INK4A与HR-HPV联合诊断，有利于提高子宫颈癌及CIN阳性预测值，为临床疾病的诊断、治疗提供科学的参考依据。

子宫颈腺癌 癌变过程 高危型人乳头状瘤病毒 P16INK4A蛋白

子宫颈癌包括鳞癌与腺癌［1］，宫颈腺上皮病变谱系为正常宫颈腺体-良性腺体增生性病变-腺体不典型增生-原位腺癌-浸润性腺癌。P16INK4A蛋白是一种重要的抑癌基因，与高危型人乳头状瘤病毒（HRHPV）有关，大部分子宫颈腺癌及上皮内瘤变的发生、发展与HPV感染、P16INK4A蛋白表达密切相关，可将P16INK4A作为子宫颈癌变的重要指标［2］。本文对2013年1月至2015年1月本院收治的25例子宫颈微腺体增生患者、65例子宫颈原位腺癌患者、24例子宫颈浸润性腺癌患者，以及35例慢性宫颈炎组织患者临床资料进行分析，探讨子宫颈腺癌组织中HR-HPV感染及P16INK4A蛋白表达的联系，现报道如下。

1　临床资料

1.1一般资料 本院门诊活检及住院手术切除宫颈石蜡包埋组织149例，年龄20～67岁，平均年龄（34.21±10.36）岁。病程1个月～14年，平均病程（3.54±0.52）年。其中包括子宫颈微腺体增生患者25例、子宫颈原位腺癌患者65例、子宫颈浸润性腺癌患者24例及慢性宫颈炎组织（慢性炎症）35例。标本采集前，患者未接受相关化疗、放疗。4组患者一般资料，包括年龄、性别、病程比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法 （1）HR-HPV DNA检测：采用第二代杂交捕获法（HC-2）进行检查，仪器由美国Digene公司提供，采样刷在宫颈管中旋转3周，保留10s后取出，样品采集需要在宫颈活检和手术切除前进行。将采样刷置于样本转移培养基保存液中，保存温度为4℃，严格按照试剂说明书进行，共检测13种HR-HPV［3］。（2）不同宫颈组织中P16INK4A蛋白检测：由美国Santa Cruz公司提供鼠抗人P16INK4A单克隆抗体，由福建迈新生物技术有限公司提供SP免疫染色试剂盒。将P16INK4A一抗稀释为1：80，PBS液代替一抗作阴性对照，以阳性乳癌切片作为阳性对照。P16INK4A阳性染色呈黄色或棕黄色，胞浆、胞核着色，在400倍镜下观察切片，重点观察10个代表性视野，计数500个中阳性细胞数，取平均值［4］。弱阳性（+）：阳性细胞10%～30%，染色强度稍弱，少量细胞着色。中度阳性（++）：阳性细胞30%～60%，胞核和胞浆着色。强阳性（+++）：阳性细胞≥60%，胞核与胞浆均着色，细胞染色较深。阴性：阳性细胞＜10%，染色强度与背景颜色无明显差异。

1.3 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。计数资料以n或%表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1不同组织中HR-HPV检查结果比较 见表1。

表1　不同组织中HR-HPV检查结果比较（n）

2.2不同组织中P16INK4A蛋白表达情况比较 子宫颈微腺体增生与慢性宫颈炎组织中P16INK4A表达以阴性表达为主，少量细胞胞核着色；其他三种组织以中、强阳性表达为主，为胞浆、胞核着色。见表2。

表2　不同组织中P16INK4A蛋白表达情况比较（n）

2.3宫颈组织中P16INK4A蛋白表达与HR-HPV感染相关性分析 宫颈组织中HR-HPV感染阳性率与P16INK4A蛋白表达率呈正相关性（r=0.565，P＜0.05）。

3　讨论

子宫颈癌是临床肿瘤科临床常见疾病，好发于30～55岁女性患者，临床表现为阴道流血、尿频、尿急、贫血、便秘、下肢肿胀、器官衰竭等，其发病原因和机制十分复杂，迄今尚未完全清楚，可能与病毒感染、性行为、分娩、营养不良、卫生条件差等因素有关［5］，直接影响患者正常生活与工作。人乳头状瘤病毒（HPV）是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中广泛分布，具有较高的特异性，可引起人类良性肿瘤与疣。生殖道感染HPV常见型为6、11、16、18，其中16、18属于HR-HPV［6］，也是感染率最高的HPV型，据相关数据显示［7］，约99%宫颈癌组织中可以检测出HPV16、18。当子宫颈受HPV16、18持续性侵袭感染时，将DNA整合在宿主细胞基因组中，病毒DNA上含有完整的E6、E7癌基因，其表达E6、E7原癌蛋白可引起自身调节，并导致宿主基因表达失调，干扰正常细胞周围调控机制，使子宫颈上皮细胞出现恶变。HC-2阳性有利于反映HR-HPV当前感染状态，仅以HRHPV感染阳性率对CIN和SCC进行筛查，可能导致一定的误诊事件。

在本资料中，采用HC-2对13种HR-HPV DNA进行检测，主要包括HPV16、18、31、33、35、39、 45、51、52、56、58、59及HPV68等，结果显示子宫颈微腺体增生、原位腺癌及浸润性腺癌患者HRHPV感染阳性率明显高于慢性宫颈炎组织（P＜0.05），同时HR-HPV感染阳性率从高到低依次为：浸润性腺癌＞原位腺癌＞子宫颈微腺体增生，提示当HR-HPV持续感染并整合入宿主细胞，才可导致宫颈上皮恶性转化，一过性感染并不能引起CIN，在应用HC-2时，无法对HPV游离状态、整合于宿主细胞进行鉴别，说明对HR-HPV感染进行检测，CIN阳性预测值始终较低，故对子宫颈癌筛查也存在一定的局限性。因此为提高子宫颈癌诊断准确性，需探寻一种准确性高的诊断方案。

P16INK4A是人体中重要的抑癌基因，在机体抗癌保护方面发挥着重要作用。近年来，临床对P16INK4A蛋白与宫颈癌关系研究不断深入，逐渐成为宫颈癌研究的重点与难点，P16INK4A蛋白在宫颈上皮细胞恶性转化前已出现，当然在慢性宫颈炎组织、子宫颈微腺体增生、原位腺癌及浸润性腺癌组织中表达水平不尽相同，随着宫颈癌前病变级别进展，P16INK4A表达水平上升。尽管P16INK4A蛋白是一种抑癌基因，但其在子宫颈癌中表达水平较高，在正常细胞受到相关因素干扰后转化为肿瘤细胞过程中，人体可通过大量分泌P16INK4A蛋白，抑制正常细胞癌变，另一方面，肿瘤细胞的“逃避机制”使P16INK4A蛋白起到“癌基因”的作用，进而出现肿瘤分级越高，P16INK4A表达水平就越高的现象。P16INK4A蛋白及产物在多数原发性癌细胞中缺失，但在HPV感染的子宫颈癌及癌前病变中表达水平较高。本资料结果显示，P16INK4A蛋白在CIN和浸润性腺癌组织中阳性率高于慢性宫颈炎组织，同时发现HR-HPV感染阳性率与P16INK4A蛋白表达率呈正相关（P＜0.05），可作为HPV基因表达和活动的标志物，并作为子宫颈早期诊断的辅助指标。因此在临床子宫颈癌诊断中，可以将HPV感染检测和P16INK4A蛋白表达联合进行筛查，能提高子宫颈癌诊断准确性，且节省财力和物力，经济性较高，具有较高的推广价值和应用价值。

［1］陈琼，屈王蕾，杨子英，等.高危型人乳头瘤病毒感染后TopoⅡα和P16INK4A蛋白的表达及诊断价值.中国微生态学杂志，2013，25（1）：25-28.

［2］王华，蔡红兵，郭广林，等.高危型HPV负荷量和p16INK4A蛋白监测评估宫颈锥切术治疗CIN.肿瘤学杂志，2012，18（9）：700-703.

［3］程静新，姚立丽，沈谷群，等.P16INK4A蛋白及HPV感染与宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞癌的关系研究.现代妇产科进展，2011，20（8）：624-627.

［4］傅小一，张子雯.p16INK4A蛋白及HPV感染与宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞癌的相关性分析.中国老年学杂志，2014，23（15）：4138-4140.

［5］王静芳，郝敏，赖炜玲，等.P16INK4A在宫颈液基细胞学涂片中的表达及意义.中国药物与临床，2015，9（5）：618-620.

［6］刘艳君，臧春逸.P16INK4a、Ki-67在宫颈上皮病变组织中的表达规律及其与HPV负荷量的相关性研究.北京医学，2011，33（11）：904-907.

［7］陈伟芳，张江宇，李荔，等.宫颈病变组织中p16蛋白表达及其与人乳头瘤病毒感染的关系.中华妇幼临床医学杂志（电子版），2009，5（6）：572-576.

Cervical adenocarcinoma Cervical intraepithelial neoplasia Papillomavirus of high risk type patients P16INK4A protein

518110 广东省深圳市龙华新区中心医院病理科

【Abstracts】 Objective To analyze and discuss infection detection of papillomavirus（HR-HPV）of high risk type cervical adenocarcinoma and clinical signifi cance of P16INK4A protein expression. Methods 25 cases of cervical intraepithelial neoplasia CIN Ⅰ，30 cases of CIN Ⅱ，35 cases of CIN Ⅲ，24 cases of infi ltrating adenocarcinoma hospitalized from January 2013 to January 2014 in our hospital were selected，at the same time，35 cases of normal cervical tissues（chronic infl ammation）were selected，the expression of p16INK4A protein was detected by immunohistochemical method，and the 13 DNA HR-HPV was detected by the second generation hybrid capture（HC-2）. Results The positive rates of CIN of cervical intraepithelial neoplasia，CINⅡ、CINⅢtissue，invasiveadenocarcinoma HR-HPV infection and the positive rate of P16INK4A protein expression were higher than those of normal cervical cells（P＜0.05）； HR-HPV infection positive ratein cervical tissues and P16INK4A protein expression were the positive correlation（P＜0.05）. Conclusions Papillomavirus（HR-HPV）of high risk patients leading to the transformation of cervical deterioration has a close relationship with the P16INK4A protein expression，it can be used as an auxiliary diagnosis index in diagnosis of cervical adenocarcinoma，using P16INK4A and HR-HPV to diagnose can improve positively predictive value of cervical cancer and CIN，and it can provide scientifi c basis for the diagnosis and treatment of clinical diseases.