EB病毒BRLF1基因及EB病毒Rta/IgG抗体在鼻咽癌中表达的临床意义

赵新星　张龙城　全超坤　韦干观　桂源　杨志



·基础研究·

EB病毒BRLF1基因及EB病毒Rta/IgG抗体在鼻咽癌中表达的临床意义

赵新星张龙城全超坤韦干观桂源杨志＊

目的探讨EB病毒BRLF1基因(EBV-BRLF1)表达量及血清EB病毒Rta/IgG(EBV-Rta/IgG)抗体浓度在鼻咽癌(NPC)早期诊断、临床分期中的意义。方法运用实时荧光定量聚合酶链反应法测量89例NPC组织的EBV-BRLF1基因表达量，采用EBV-Rta/IgG定量抗体试剂盒检测228例血清的Rta/IgG抗体浓度，分析它们与NPC早期诊断、临床分期的相关性。228例血清包括NPC组89例、鼻咽部慢性黏膜炎病例(高危组)19例和同期健康人群120例。结果89例NPC组血清的EBV-Rta/IgG抗体浓度为(111.81±76.77)U/mL,灵敏度为75.3%(67/89)，特异度为94.2%(131/139)，诊断符合率为86.8%(198/228)；19例高危组血清的EBV-Rta/IgG抗体浓度为(15.14±33.04)U/mL,120例健康体检组血清的EBV-Rta/IgG抗体浓度为(6.63±11.26)U/mL；各组间比较浓度差异具有统计学意义(P<0.05)。EBV-BRLF1基因在NPC肿瘤组织中的表达率为63.51%(47/74)，中位表达量为8.53。NPC组中EBV-BRLF1基因表达量与N分期、M分期及临床分期无关(P>0.05)，与T分期差异有关(P=0.061)，接近临界范围。血清EBV-Rta/IgG抗体浓度与N分期、M分期及临床分期无关(P>0.05)。在T分期组间比较中发现，T3期呈一定上升趋势，T2与T3组间差异具有统计学意义(P=0.048)。结论EBV-BRLF1基因在NPC组织中高度表达；EBV-Rta/IgG定量抗体试剂盒检测可以作为早期筛查NPC的临床指标之一；EBV-BRLF1基因表达量及血清EBV-Rta/IgG抗体浓度与NPC的N分期、M分期及临床分期无关，与T分期局部组织浸润呈一定相关性。(中国眼耳鼻喉科杂志，2016,16：243-247)

鼻咽癌；EB病毒BRLF1基因；EB病毒Rta/IgG抗体；临床意义

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一种源于鼻咽部上皮组织恶性程度较高的肿瘤。其最终诊断依赖于活检组织病理，但对于一些早期及不典型的病例不一定能取到癌组织。因此，快速、方便、准确的血清学检测是早期有效发现NPC的一种方法。EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)与NPC的发生、发展密切相关，EBV立即早期基因BRLF1(EBV-BRLF1)的表达对病毒基因组具有反式激活作用，能够引发裂解感染期基因“瀑布式表达”，诱导鼻咽部细胞发生癌变[1]。通过对EBV抗体谱的进一步探索，国内多数研究[2-5]表明，通过检测血清中EBV特异性抗体Rta/IgG(EBV-Rta/IgG)可以为NPC早期筛查提供依据，有助于辅助NPC的早期诊断。本研究采用实时荧光定量多聚酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-Q-PCR)法检测NPC患者鼻咽部肿瘤组织中BRLF1基因的表达量及酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA)定量检测血清中EBV-Rta/IgG抗体的浓度，以探讨其与NPC临床参数间的关系及意义。

1　材料与方法

1.1材料收集2013年8月～2014年12月在我科就诊疑似NPC患者的血清及鼻咽部组织样本共108例。其中经病理确诊为非角化性未分化癌(NPC组)89例，男性68例、女性21例；年龄15～77岁，中位年龄48岁。所有病例均按“鼻咽癌2008 分期”[6]进行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期4例、Ⅲ期50例、Ⅳ期35例。经病理确诊为鼻咽部慢性黏膜炎病例(高危组)19例，男性13例、女性6例；年龄15～62岁，中位年龄36岁。同期健康人群体检血清样本(健康体检组)120例，男性80例、女性40例；年龄25～67岁，中位年龄42岁。3组年龄、性别比例差异无统计学意义(P>0.05)。所有样本均得到医院医学伦理审查委员会批准，并在患者知情同意后获得。血清样本要求清亮、无沉淀，每份≥1 mL，在-20 ℃条件下冻存。用于检测EBV-BRLF1基因mRNA的组织厚度≤0.5 cm，保存于RNAstore溶液中，-80 ℃条件下冻存。

1.2主要试剂及仪器Rta/IgG定量抗体检测试剂盒由同昕生物技术(北京)有限公司提供，TIAN GEN牌 RNAstore、EBV-BRLF1及内参基因EF1a引物由华大合成提供，总RNA提取液为QIAGEN公司的RNeasy Mini 试剂盒。酶标仪(双波长450 nm/630 nm)，Gene Amp PCR System9700 扩增仪(ABI 公司，美国)，Nano Drop 2000超微量分光光度计，电泳槽，PCR Light Cycler 480 扩增仪(Roche 公司)。

1.3实验方法RT-Q-PCR：取冻存组织，经溶解、研磨、分离、沉淀等处理后，使用Dnase I去除基因组DNA，参考RNeasy Mini 试剂盒说明书提取总RNA。根据NanoDrop 吸光度值提取约1 μg总RNA进行反转录反应。反应条件:70 ℃变性，冰浴3 min，37 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min。反转录所得cDNA稀释4倍进行RT-Q-PCR检测。目的基因及内参基因在不同的反应管中进行扩增，每个测定基因做3次重复，反应体系均为20 μL，反应条件:95 ℃变性20 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，35个循环；PCR Light Cycler 480 扩增仪记录各样本达到荧光阈值的循环数(threshold cycle，Ct值)。假设2个样本的内参Ct值一样，那么某个样本的目的基因含量越高，其Ct值就越小，目的基因与内参Ct值的差值越小。结果采用RT-Q-PCR中的相对定量法，即目的基因表达量=2- △△Ct法[7]计算。△Ct值=(CtBRLF1RNA-CtEF1aRNA)，这个值代表目的基因的相对含量，△Ct Max为目的基因表达量最低，或内参基因表达量相对最高；△△Ct=△Ct-△Ct Max，该值越小，目的基因表达越高；当Ct值为35时，可以认为该基因片段没有表达。该法是RT-Q-PCR实验中分析基因相对表达量的一种简便方法。

定量检测Rta/IgG抗体浓度采用ELISA，按产品说明书操作规程进行操作。将酶标仪设定在双波长450 nm/630 nm，测量各孔吸光度值，用校准品的含量及其对应的吸光度值进行log(X)-log(Y)直线回归方程拟合，将待测样品的吸光度值代入拟合曲线拟合方程，计算出相对应的浓度值。本实验试剂盒校准品曲线的相关系数(r)为0.996 5，以30 U/mL为临界值对检测结果进行判定。

1.4统计学处理采用SPSS 18.0 软件进行统计学分析，变量进行正态性检验。血清Rta/IgG抗体浓度值在TNM分期、临床分期组间关系分析采用t检验和χ2检验；BRLF1基因表达量在不同分期间关系分析采用 Kruskal-Wallis检验，2组之间比较采用Mann-Whitney 检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1BRLF1基因在NPC组和高危组中的表达情况NPC组中位数值明显高于高危组，差异具有统计学意义(Z=-4.221，P<0.05)；其中NPC组BRLF1基因的表达率为63.51%(47/74)；高危组Ct值为35的有15例，占93.75%(表1)。

表1　NPC组和高危组中BRLF1基因RT-Q-PCR表达情况

注：a示由于各种原因导致部分组织样本没能提取出理想总RNA，以至于RT-Q-PCR未能进行

2.2血清Rta/IgG抗体在不同组间的结果比较从表2可以看出，NPC组Rta/IgG平均浓度明显高于高危组、健康体检组，组间差异具有统计学意义(P<0.05)。89例NPC血清的Rta/IgG抗体表达阳性67例，灵敏度为75.3%(67/89)，特异度为94.2%(131/139)，诊断符合率为86.8%(198/228)。

表2　血清Rta/IgG抗体在不同组间的结果

注：a示与高危组、健康体检组比较，t值分别为-8.692，-12.823，P值均<0.05

2.3NPC患者BRLF1基因表达量及血清Rta/IgG抗体浓度与TNM分期、临床分期的关系各组数据经正态性检验，BRLF1基因表达量呈偏态分布。NPC患者血清Rta/IgG抗体浓度、BRLF1基因表达量与TNM分期、临床分期的关系见表3。

血清Rta/IgG抗体浓度在各N分期、M分期、临床分期中的比较，差异均无统计学意义(χ2=0.241，0.002，0.981，P=0.745，0.968，0.379)；T分期整体差异无统计学意义(χ2=1.289，P=0.283)，但在T2与T3组间比较中，差异具有统计学意义(P=0.048)。BRLF1基因表达量在各N分期、M分期、临床分期中的比较，差异均无统计学意义(χ2=2.184，0.068，4.748，P=0.336，0.795，0.093)；在T分期的关系比较中(χ2=6.998，P=0.061)，P值接近临界范围，提示基因表达量与T分期可能具有潜在的意义。

表3　 NPC患者BRLF1基因表达量、血清Rta/IgG抗体浓度与TNM分期、临床分期的关系

3　讨论

EBV是一种普遍存在于人体的疱疹病毒，感染后常形成终身潜伏期感染，进入裂解期后与NPC的发生、发展密切相关。有研究[8-9]发现，BRLF1是EBV的立即早期基因，参与整个裂解感染的启动过程，作为一种反式激活因子调节EBV早、晚期裂解期基因组的复制和表达,其表达产物Rta蛋白与EBV从潜伏期向裂解期的转换密切相关。Rta蛋白可以在B淋巴细胞、上皮细胞中激活多种病毒基因的启动子,如BMLFI,BARFI,BALF5等[10]，能够有效激活EBV进入裂解复制状态，对宿主肿瘤细胞的生长增殖具有调控作用,对其发生、发展起到一定的影响。因此研究BRLF1基因及其产物Rta能为NPC的筛查和治疗提供线索。目前尚鲜见关于NPC组织BRLF1基因的表达量及血清EBV-Rta/IgG抗体的浓度与NPC 2008临床分期的报道。

传统的PCR技术不能准确定量，在操作过程中易受污染而使假阳性率偏高；RT-Q-PCR技术拥有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，已成为分子生物学研究的重要工具[11-12]。本研究应用RT-Q-PCR方法检测74例NPC组及16例高危组鼻咽部组织BRLF1基因的表达情况，发现NPC组Ct<35的有47例，BRLF1基因表达率为63.51%(47/74)；高危组Ct=35的15例，另有1例为34.25；NPC组织中BRLF1基因中位表达量为8.53，而高危组为2.14，两者差异具有统计学意义(P<0.05)，说明BRLF1基因在NPC组织中高度表达，且在NPC发生中起着重要作用。这与Feng等[13]运用PT-PCR对鼻咽部活检组织(NPC组和非NPC组)中的EBV早期裂解基因表达情况研究相一致。他们认为，在NPC组和非NPC组中BZLF1、BALF2、BCLF1均能检出，但只有BRLF1在NPC组织中检测出，而正常组织中未能检出。采用ELISA检测血清Rta/IgG抗体和其他EBV抗体水平，分析比较各组血清抗体的灵敏度和特异度。国内不少研究[2-5]认为检测血清Rta/IgG抗体是一项简单、可靠的方法，可用来早期筛选NPC患者。本次实验采用定量Rta/IgG抗体检测试剂盒，通过测量各孔的吸光度值，根据校准品拟合的直线回归方程，计算出相对应的浓度。从表2对228例患者血清中EBV-Rta/IgG抗体的浓度可得知，NPC组的浓度明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。唐国全等[14]以检测血清样本的相对吸光度值作为标准来判断Rta/IgG抗体的诊断价值，其灵敏度为89.3%(134/150)，特异度为88.7%(133/150)。本次实验采用定量试剂盒检测血清中Rta/IgG抗体浓度的灵敏度为75.3%，特异度为94.2%，诊断符合率为86.8%，结果与上述报告基本相近。具体不同可能与检测试剂盒、检测方法、阳性判断标准及样本量的差异等有关。本研究通过评价Rta/IgG抗体定量试剂盒在NPC诊断中的作用，结果表明其在NPC的早期筛查、诊断中具有较高的敏感度、准确度，有一定的临床参考价值。

在分析血清Rta/IgG抗体水平与不同TNM分期及临床分期的相关性研究中，蔡永林等[15]通过测量NPC患者血清Rta/IgG抗体相对吸光度值，认为EBV-Rta/IgG表达与NPC 92′分期无关，其研究用样本数量有限，且未能测得具体浓度值，能否对NPC临床分期进行相关指导，可靠性尚不能确认。本文的表3具体分析NPC病例中BRLF1基因表达量及Rta/IgG抗体的浓度与NPC分期是否存在一定的关系，通过对比各组间的关系，发现在N分期、M分期、临床分期中差异均无统计学意义。在T分期的相关性比较中，发现BRLF1基因表达量P值接近临界范围(P=0.061)，Rta/IgG抗体的浓度值在T2与T3组间比较,T3浓度较T2高，组间差异具有统计学意义(P=0.048)，提示上述检测值与NPC的周围浸润情况T分期可能呈一定的相关性。我们发现，随着临床分期增加，EBV-BRLF1基因表达量的四分位距有下降趋势，可能是BRLF1作为一种EBV的立即早期基因，参与病毒基因组的早期表达，其反式激活作用，引发病毒裂解感染期基因“瀑布式表达”，诱导鼻咽部细胞发生癌变。Rta蛋白为溶解期抗原，在EBV由潜伏期向裂解期转换的过程中发挥关键作用。当肿瘤经过T2期发展阶段后,EBV-BRLF1表达及Rta抗原相对增多，浸润范围扩大，颈部淋巴结转移同步发生，可以刺激机体的免疫系统产生更多的抗体，使得Rta/IgG抗体值有一定程度的上升。随着病情进一步发展到T4阶段，EBV-BRLF1表达量相对恒定及其抑制体内IRF3、IRF7转录和抑制干扰素-β诱导，逃避宿主天然免疫应答[16]，机体处于免疫极低状态，免疫细胞间的原动态平衡被打破，新平衡建立，使得Rta/IgG抗体浓度值相对稳定。这可能是导致NPC患者血清Rta/IgG抗体浓度在不同T分期中呈现相应改变的原因，具体的机制值得进一步深入研究。

综上所述，定量检测血清Rta/IgG抗体浓度在NPC早期筛查、诊断中具有较高的临床价值。NPC组织EBV-BFLF1基因表达量及血清Rta/IgG抗体浓度，在不同N分期、M分期、临床分期中大致相同；在T3期呈一定的上升趋势，提示EBV-BFLF1基因及其产物在NPC的局部组织浸润中起到特定的作用，为进一步探索NPC发生、发展、转移提供参考价值。

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(本文编辑杨美琴)

Clinical significance of EBV-BRLF1 gene and EBV-Rta/IgG antibody expression in nasopharyngeal carcinoma

ZHAOXin-xing,ZHANGLong-cheng,QUANChao-kun,WEIGan-guan,GUIYuan,YANGZhi＊.

DepartmentofOtolaryngology,People’sLibrationArmy303Hospital,Nanning530021，ChinaCorresponding author： ZHAO Long-cheng, Email: zhlc_303@163.com

ObjectiveTo explore the significance of Epstein-Barr virus BRLF1 (EBV-BRLF1) gene expression and serum EBV-Rta/IgG antibody concentration on early diagnosis and clinical staging of nasopharyngeal carcinoma (NPC).MethodsReal-time quantitative polymerase chain reaction(RT-Q-PCR) was used to measure the EBV-BRLF1 gene expression of 89 NPC tissues, and quantitative EBV-Rta/IgG antibody kit was used to detect the serum Rta/IgG antibody concentration of 228 clinical samples. The correlation between the NPC early diagnosis and clinical stages was analyzed. The serum samples included 89 NCP, 19 cases with chronic nasophayngeal mucosal inflammation and 120 healthy people.ResultsThe mean value of EBV-Rta/IgG concentration in 89 NPC patients was (111.81±76.77)U/mL, with a sensitivity of 75.3%(67/89)and specificity of 94.2% (131/139) and diagnosis coincidence rate of 86.8%(198/228); The mean value of EBV-Rta/IgG concentration in 19 high risk group and 120 healthy volunteers were (15.14±33.04) U/mL and (6.63±11.26) U/mL; There were significant difference between NPC and other groups(P<0.05).EBV-BRLF1 gene expression rate in NPC tumor tissue was 63.51%(47/74),with median amount was 8.53. No significant difference in EBV-BRLF1 gene expression level was found in the NPC patients in different N, M or clinical stages (P>0.05) while the difference in T stage (P=0.061) was near to the critical range. No significant difference in EBV-Rta/IgG antibody concentration was found in the NPC patients in different N, M or clinical stages (P>0.05). But in comparison among T stages, it was found that T3 rise by a certain trend and the difference between T3 and T2 groups was statistically significant (P=0.048).ConclusionsEBV-BRLF1 was highly expressed in NPC tumor tissues; Quantitative EBV-Rta/IgG antibody kits can be used as a clinical indicator of early screening for NPC； The expression of EBV-BRLF1 gene and concentration of serum EBV-Rta/IgG antibody were not associated with N, M or clinical stages, but had a certain correlation with the T staging concerning local tissue invasion.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol, 2016,16: 243-247)

Nasopharyngeal carcinoma; Epstein-Barr virus BRLF1 gene; Epstein-Barr virus Rta/IgG antibody; Clinical significance

中国人民解放军第三○三医院耳鼻咽喉头颈外科南宁530021；＊中国农业大学生命科学研究中心北京100193

张龙城(Email：zhlc_303@163.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.04.004

2015-08-25)