转染miR-200b基因的鼻咽癌CNE2细胞增殖、侵袭能力变化及其机制

张先锋，黄远见，肖娟

(南华大学附属第二医院，湖南衡阳421000)



转染miR-200b基因的鼻咽癌CNE2细胞增殖、侵袭能力变化及其机制

张先锋，黄远见，肖娟

(南华大学附属第二医院，湖南衡阳421000)

目的观察转染miR-200b基因的鼻咽癌CNE2细胞增殖及侵袭能力变化，并探讨其机制。方法 将鼻咽癌CNE2细胞分为观察组1、对照组1、观察组2、对照组2、观察组3。观察组1转染miR-200b模拟物，对照组1转染无关序列，观察组2转染BMI-1小干扰RNA(BMI-1 siRNA)，对照组2转染RNA干扰无关序列，观察组3转染miR-200b抑制剂与BMI-1 siRNA。采用MTT实验观察细胞增殖能力，采用Transwell侵袭实验观察细胞侵袭能力。采用双荧光素酶报告基因检测系统检测BMI-1结合位点荧光素酶活性，Western blotting法检测BMI-1蛋白，qRT-PCR检测BMI-1 mRNA。结果 观察组1与对照组1相比，观察组2与对照组2相比，细胞48、72、96 h增殖能力减弱，(P均<0.05)。观察组1、对照组1、观察组2、对照组2、观察组3穿膜细胞数分别为(77.5±8.5)、(147.7±13.6)、(81.2±7.4)、(149.1±10.8)、(126.4±11.2)个；观察组1与对照组1相比，观察组2与对照组2相比，P均<0.01。miR-200b能与BMI-1非编码区结合，抑制BMI-1蛋白、mRNA的表达。结论 转染miR-200b基因的鼻咽癌CNE2细胞增殖与侵袭能力降低，这可能是通过下调BMI-1实现的。

鼻咽癌；微小RNA-200b；细胞增殖；细胞侵袭

微小RNA(miRNA)是非编码小RNAs，其在转录后基因表达调控起重要的作用[1]。在miR-200家族中，miR-200b被认为是调控肿瘤上皮间质化(EMT)及肿瘤细胞耐药性最重要的家族成员，在肿瘤中的作用越来越被重视[2]。研究[3]表明，miR-200b可通过靶向调控锌指转录因子4(GATA4)，进而下调细胞周期蛋白D1的表达，诱导细胞分化，miR-200b表达缺失可促进乳腺癌细胞向干细胞转化。研究[4]表明，miR-200b在鼻咽癌组织中表达下调，具有抑制鼻咽癌生长的作用，但具体作用机制尚不清楚。因此，本研究观察了转染miR-200b基因的鼻咽癌CNE2细胞增殖及侵袭能力变化，并探讨其机制。

1　材料与方法

1.1主要材料鼻咽癌CNE2细胞株由南华大学肿瘤研究所惠赠；TRIzol和Lipofectamin2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；基质胶与Transwell小室购于康宁公司(美国)；miR-200b模拟物(miR-200b mimics)、无关序列(scramble)、miR-200b抑制剂(miR-200b inhibitors)、BMI-1小RNA干扰(BMI-1 siRNA)、RNA干扰无关序列(control siRNA序列)均由Ambion公司设计合成；BMI-1 3′UTR的各种报告基因由复能基因公司构建；RNA抽提试剂盒购于Ambion公司(美国)；BMI-1和β-actin抗体购于Santa Cruz公司(美国)。

1.2细胞分组与转染培养鼻咽癌CNE2细胞，采用胰酶消化预先培养好的CNE2细胞并接种于6孔板中，按2 mL/孔铺好，培养至细胞汇合度为30%～50%时用于转染。用灭菌的无酶水稀释上述各种转染质粒干粉，按说明配制成20 μmol/L的溶液备用。用不含血清的Opti-MEM培养液分别稀释100 pmol转染质粒与5 μL的Lipofectamin2000，混匀，室温孵育5 min。将鼻咽癌CNE2细胞分为观察组1、对照组1、观察组2、对照组2、观察组3，观察组1转染miR-200b mimics，对照组1转染scramble，观察组2转染BMI-1 siRNA，对照组2转染control siRNA，观察组3转染miR-200b inhibitors与BMI-1 siRNA，培养48 h，收获细胞。

1.3miR-200b对细胞增殖能力的影响观察采用MTT实验。使用胰酶消化上述5组细胞，分别取1 000个细胞接种于96孔板中，每组设5个复孔，在未接种细胞的孔中加入RPMI1640作调零孔。置于37 ℃、5% CO2培养箱中分别培养24、48、72、96 h后，每孔加20 μL MTT液，37 ℃继续孵育4 h，每孔中加入DMSO 150 μL，低速振荡10 min。使用多功能酶标仪，于570 nm波长处测定其OD值，同时设置490 nm波长的背景对照，实验重复3次。OD值代表细胞增殖能力。

1.4miR-200b对细胞侵袭能力的影响观察采用Transwell侵袭实验。将基质胶稀释液铺置在transwell小室中，放置成膜。取100 μL上述5组细胞稀释液接种至小室上腔，取500 μL含10%胎牛血清培养基添加至下腔，小室放置在37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养36 h后取出，擦弃小室上层细胞并用4%甲醛固定，0.1%结晶祡染色，PBS液洗涤，晾干。光学显微镜下观察并随机选取4个高倍视野进行细胞计数，取平均值。

1.5CNE-2细胞中miR-200b与BMI-1靶向关系验证方法①采用双荧光素酶报告基因检测系统观察miR-200b对BMI-1结合位点荧光素酶活性。根据BMI-1基因3′UTR序列与miR-200b结合位点设计合成野生型引物序列(BMI-1-wt)以及突变体引物序列(BMI-1-mut)，上下游引物分别引入限制性内切酶Spe Ⅰ和HindⅢ识别位点。当相应的正义和反义链扩增退火完成后，将其连接到含有荧光素酶报告基因的载体质粒上。将鼻咽癌CNE-2细胞分为实验组1、2、3、4组，实验组1转染miR-200b、BMI-1-wt，实验组2转染scramble、BMI-1-wt，实验组3转染miR-200b、BMI-1-mut，实验组4转染scramble、BMI-1-mut，48 h后收获细胞，采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性，实验独立重复3次。②采用Western blotting法观察miR-200b对BMI-1蛋白的影响。将鼻咽癌CNE-2细胞接种到24孔板中，分别转染miR-200b mimics与scramble序列，48 h后收集细胞，并提取细胞总蛋白。BCA蛋白定量试剂盒测定细胞蛋白，100 ℃水浴10 min，取等量的总蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳，并转至PVDF膜上。TBST洗膜，用含有5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h后分别加入鼠抗人BMI-1单克隆一抗4 ℃封闭过夜。去除一抗，TBST洗膜3次，加入二抗，37 ℃孵育45 min，TBST洗膜3次，暗室中用蛋白荧光检测试剂盒显示结果于X光片。扫描图片，以灰度值作为蛋白相对表达量。③采用qRT-PCR观察miR-200b对BMI-1 mRNA的影响。将鼻咽癌CNE-2细胞接种到24孔板中，分别转染miR-200b mimics与scramble序列，48 h后收集细胞，并抽提细胞中总RNA。逆转录合成cDNA于-80 ℃冰箱保存。PCR扩增反应体系为20 μL，其中miR-PCR primers(5 mmol/L)0.4 μL、miRNA RT product 2.0 μL、Taq DNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL、2×SYBR Mix 10 μL、灭菌蒸馏水7.4 μL。混匀，反应条件如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环；溶解曲线条件为95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以U6 snRNA为内参，所测定的BMI-1 mRNA的相对表达量采用2-ΔΔCt法分析。

2　结果

2.1各组鼻咽癌CNE2细胞增殖能力比较结果见表1。

表1　不同培养时间各组鼻咽癌CNE2细胞OD值比较

注：与对照组1相比，*P<0.05，**P<0.01；观察组2与对照组2相比，#P<0.05，##P<0.01。

2.2各组CNE2细胞侵袭能力比较观察组1、对照组1、观察组2、对照组2、观察组3穿膜细胞数分别为(77.5±8.5)、(147.7±13.6)、(81.2±7.4)、(149.1±10.8)、(126.4±11.2)个；观察组1与对照组1相比，观察组2与对照组2相比，P均<0.01；观察组3与对照组1、对照组2相比，P均>0.05。

2.3CNE-2细胞中miR-200b与BMI-1的靶向关系实验组1、2、3、4组CNE2细胞荧光素酶活性强度分别为0.543±0.048、0.926±0.087、0.882±0.075、0.904±0.069；实验1组与实验2组比较，P<0.01；实验3组与实验4组比较差异无统计学意义。鼻咽癌CNE2细胞转染miR-200b mimics 48 h后BMI-1蛋白灰度值为0.458±0.044，较转染scramble者(1.144±0.111)下调(P<0.01)。鼻咽癌CNE2细胞转染miR-200b mimics 48 h后BMI-1 mRNA表达值为0.394±0.052，较转染scramble者(0.925±0.086)明显下调(P<0.01)。

3　讨论

miRNA失调与多种疾病病理过程相关。Calin等[5]发现，大约19%的编码miRNA基因区域位于邻近脆性位点，大约50%位于肿瘤相关的基因组区域，其中43%位于杂合子缺失或基因扩增区域。位于肺癌基因组扩增区域的miR-21和miR-205具有促进肺癌发生发展的重要作用[6]，而位于肺癌基因组缺失区域的miR-126、miR-186起抑制肺癌细胞增殖的作用[7,8]。这些数据提示miRNA很可能在肿瘤发生发展过程中发挥着重要的生物学作用。细胞异常增殖和侵袭对于原发肿瘤的形成、维持和进展尤为重要。miR-21通过靶向下调PTEN基因、反转录富含半胱氨酸蛋白(RECK)或基质金属蛋白酶抑制因子3(TIMP3)等肿瘤抑制蛋白的表达，促进乳腺癌、肺癌和食管癌等多种肿瘤细胞在体内外的增殖、侵袭迁移、肿瘤生长和远处转移[9]。Let-7则可抑制多种肿瘤的细胞增殖和侵袭迁移[10]。miR-200家族能够靶向抑制E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)和E盒结合锌指蛋白2(ZEB2)促进上皮样肿瘤细胞间质化而获得转移能力，因此miR-200家族表达下调可通过诱导肿瘤细胞发生EMT进而发生远处转移[11]。可见，miRNA既可以发挥癌基因促进肿瘤的作用，也可具有抑癌基因的特点。建立miRNA在特定肿瘤甚至某种肿瘤特定亚型中的表达谱、临床相关性和生物学功能，阐明miRNA参与特定肿瘤发生发展的分子机制，是当前肿瘤基础研究中的热点。

研究[12,13]表明，miR-200b在肿瘤细胞增殖、侵袭与转移过程中发挥重要作用。在上皮性肿瘤中miR-200b可以调控肿瘤细胞EMT转化、细胞增殖及细胞耐药性产生[14]。miR-200b在前列腺癌与胃癌中参与EMT、肿瘤干细胞的形成与维持以及肿瘤的侵袭[15,16]。miR-200b能抑制鼻咽癌细胞的生长[4]，然而miR-200b在鼻咽癌发展过程中的具体调控机制目前尚未明确。本研究通过荧光素酶报告载体系统证实BMI-1是miR-200b的靶基因，miR-200b高表达能直接抑制鼻咽癌细胞中BMI-1蛋白、mRNA的表达。BMI-1调控的染色质沉默参与多种基本细胞过程，如细胞增殖、凋亡、衰老、EMT以及干细胞维持[17,18]。BMI-1在多种人类恶性肿瘤(如白血病、肺癌、肠癌、乳腺癌以及头颈癌)中高表达，且其表达往往与肿瘤的临床分期、病理分级、治疗反应以及预后相关[19～22]。此外，BMI-1在维持正常和恶性肿瘤干细胞的自我更新能力中也担任不可或缺的角色[17,23,24]。研究[25]表明，沉默细胞中BMI-1的表达能抑制细胞增殖、诱导凋亡，还能增强细胞对化疗药物的敏感性。这些研究都证实BMI-1在肿瘤发生过程中是重要的多向致癌调控因子，阻断BMI-1表达/活化以及其下游信号级联是一种很有前途的新型抗癌治疗策略。本研究沉默鼻咽癌细胞中的BMI-1后，细胞的增殖与侵袭能力均明显受到抑制，且与在鼻咽癌细胞中外源高表达miR-200b的效果相当。我们发现观察组3与对照组1、对照组2细胞的增殖与侵袭能力差异无统计学意义，提示miR-200b可能通过下调BMI-1抑制鼻咽癌细胞增殖与侵袭。

综上可见，转染miR-200b基因的鼻咽癌CNE2细胞增殖与侵袭能力降低，这可能是通过下调BMI-1表达实现的。

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湖南省科技厅资助项目(2014SK3081)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.010

R739.41

A

1002-266X(2016)31-0034-04

2016-01-09)