KLF4基因沉默大鼠肝星状细胞中Smad 2、3、7mRNA及蛋白表达观察

李涛，牛丽娟，刘文宣，杨磊，李曼，曹丹丹，刘殿武

(1河北医科大学公共卫生学院，石家庄050017；2石家庄市第三医院)



KLF4基因沉默大鼠肝星状细胞中Smad 2、3、7mRNA及蛋白表达观察

李涛1，牛丽娟2，刘文宣1，杨磊1，李曼1，曹丹丹1，刘殿武1

(1河北医科大学公共卫生学院，石家庄050017；2石家庄市第三医院)

目的观察Kruppel样因子4(KLF4)基因沉默对大鼠肝星状细胞HSC-T6中Smad 2、3、7 mRNA及蛋白表达的影响。方法 设计并构建针对大鼠KLF4基因的3个干扰质粒(pGPU6-1、pGPU6-2、pGPU6-3)，将质粒转染HSC-T6细胞，检测KLF4 mRNA及蛋白，筛选出沉默效果最好的重组质粒用于后续实验。将HSC-T6细胞分为A、B、C、D组，A组常规培养细胞；B组在培养液中加入TGF-β150 ng/mL；C组转染重组质粒pGPU6-3；D组转染干扰质粒pGPU6-3 24 h后，再加入TGF-β150 ng/mL。采用real-time PCR法检测各组细胞中的Smad2、Smad3、Smad7 mRNA。采用Western blotting法检测各组细胞中的Smad2、Smad3、Smad7蛋白和磷酸化Smad2、3(p-Smad2、3)蛋白。结果 B、D组细胞中Smad2、Smad3、Smad7 mRNA相对表达量高于A组，C组细胞中Smad7 mRNA相对表达量高于A组(P均<0.05)。C组、D组细胞中p-Smad2、p-Smad3蛋白相对表达量低于A组，Smad7蛋白相对表达量高于A组(P均<0.05)。B组细胞中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白相对表达量均高于A组(P均<0.05)。结论KLF4基因沉默后，HSC-T6细胞(包括被TGF-β1激活的HSC-T6)中p-Smad2、p-Smad3蛋白表达下调，Smad7 mRNA及蛋白表达上调；抑制KLF4基因表达可能有抗纤维化作用，作用机制与抑制TGF-β1/Smad信号通路激活有关。

Kruppel样因子4基因；人肝星状细胞；转化生长因子β1；Smad；基因沉默；肝纤维化

肝损伤到肝纤维化至肝癌的病变过程中，肝纤维化是关键的中间环节，许多细胞因子和信号通路在其中发挥重要调节作用[1,2]。转化生长因子β1(TGF-β1)已被广泛证明是加速肝纤维化的一个重要因子[3]。TGF-β1主要通过TGF-β1/Smad信号通路激活肝星状细胞(HSCs)，增加细胞外基质(ECM)合成，使ECM合成超过了肝脏的降解能力，进而导致肝纤维化发生[4,5]。KLF4是Kruppel样因子(KLFs)家族的重要成员，具有调节细胞增殖、分化及凋亡等重要功能[6]。本研究沉默了大鼠HSCs中KLF4基因表达，观察KLF4基因沉默对大鼠HSCs中Smad 2、3、7 mRNA及蛋白表达的影响，现报告如下。

1　材料与方法

1.1细胞与试剂大鼠HSC-T6购自中南大学湘雅医院细胞中心；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青链霉素购自美国GIBCO公司；Liprofectamine 2000、TRIzol reagent购自美国Invitrogen公司；SYBR Green real-time试剂盒购自北京百泰克公司；M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒购自美国Gene Copoeia公司；无内毒素质粒大提试剂盒购自北京天根公司；兔抗大鼠Smad2、Smad3单克隆抗体购自美国Gene Tex公司；兔抗大鼠Smad7、磷酸化Smad2(p-Smad2)、磷酸化Smad3(p-Smad3)多克隆抗体购自美国GeneTex公司；兔抗大鼠β-actin单克隆抗体购自美国Epitomics公司；IRDye800 Anti-Rabbit IgG购自美国Rockland公司。

1.2KLF4 siRNA序列设计与筛选

1.2.1KLF4 siRNA序列设计参考GenBank中的大鼠KLF4的基因序列，分别设计三对siRNA序列，同时设计一条阴性对照dsRNA。用含U6启动子的pGPU6/GFP/Neo表达质粒，构建RNA干扰重组体。干扰质粒pGPU6-1靶序列为5′-GGACCTAGACTTTATCCTTTC-3′；干扰质粒pGPU6-2靶序列为：5′-GGTCATCAGTGTTAGCAAAGG-3′；干扰质粒pGPU6-3靶序列为5′-GGAACTCTCTCACATGAAGCG-3′；干扰质粒pGPU6阴性对照靶序列为5′-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.2.2干扰质粒转染HSC-T6在37 ℃ 5% CO2培养箱中，用含12%胎牛血清的DMEM培养基常规培养HSC-T6细胞。当细胞生长至合适汇合度时用0.25%胰蛋白酶消化细胞，传代培养，待细胞处于对数生长期时用于实验。用天根公司质粒抽提试剂盒将构建好的干扰载体重组质粒从保存菌DH5α中抽提出来。转染前1 d将细胞接种至6孔板，转染前6 h更换为无抗生素的Opti-MEM培养基，至70%汇合度时转染。于转染后24 h检测KLF4 mRNA，转染后48 h检测KLF4蛋白，筛选沉默效果最好的siRNA序列。

1.2.3HSC-T6细胞中KLF4 mRNA及蛋白检测①KLF4 mRNA检测：内参GAPDH基因上游引物序列为5′-CAAGTTCAACGGCACAGTCA-3′、下游引物序列为5′-CCATTTGATGTTAGCGGGAT-3′，KLF4 mRNA上游引物序列为5′-GAACTGACCAGGCACTACCG-3′、下游引物序列为5′-CTTGCTGGGAACTTGACCAT-3′；PBS清洗细胞，采用TRIzol试剂提取细胞总RNA，提取细胞总RNA 2 μg，反转录为cDNA，取cDNA 2 μL于20 μL反应体系中进行反应，循环条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共35个循环；每个样本重复3次，以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。②KLF4蛋白检测：采用Western blotting法，用Odyssey扫描仪对PVDF膜进行扫描显影并保存图像，计算灰度值，作为目的蛋白相对表达量。pGPU6-1组、pGPU6-2组、pGPU6-3组KLF4 mRNA相对表达量分别为0.601±0.043、0.548±0.051、0.282±0.027，KLF4蛋白相对表达量分别为0.513±0.032、0.475±0.042、0.305±0.035，其中pGPU6-3组KLF4 mRNA及蛋白相对表达量最低(P均<0.05)，故选择pGPU6-3用于后续实验。

1.3细胞分组与KLF4基因沉默方法将HSC-T6细胞分为A、B、C、D组。A组用含12%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞；B组在含12%胎牛血清的DMEM培养液中加入TGF-β1细胞干预液，使其终浓度为50 ng/mL；C组将干扰质粒pGPU6-3转染HSC-T6细胞；D组转染干扰质粒pGPU6-3 24 h后，再加入TGF-β1细胞干预液，使其终浓度为50 ng/mL。

1.4HSC-T6细胞中Smad2、Smad3、Smad7 mRNA检测各组细胞按分组处理后24 h后消化、收集上述各组细胞，提取细胞RNA，采用real-time PCR检测Smad2、Smad3、Smad7 mRNA，方法参考“1.2.3”。Smad2基因上游引物序列为5′-TCACAGCCATCATGAGCTCAAGG-3′、下游引物序列为5′- TGTGACGCATGGAAGGTCTCTC-3′，Smad3基因上游引物序列为5′-CCAGTGCTACCTCCAGTGTT-3′、下游引物序列为5′-CTCGGTGTCGCTAGTTTCTC-3′，Smad7基因上游引物序列为5′-GGCTTTCAGATTCCCAACTTC-3′、下游引物序列为5′- CGCCATCCACTTCCCTTGT-3′，内参GAPDH基因上游引物序列为5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTCTA-3′、下游引物序列为5′-AGTGGGAGTTGCTGTTGAAATC-3′。

1.5HSC-T6细胞中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白检测各组细胞按分组处理后48 h，消化、收集上述各组贴壁细胞，提取细胞蛋白，采用Western blotting法检测目的蛋白，用Odyssey扫描仪对PVDF膜进行扫描显影并保存图像，计算灰度值，作为目的蛋白相对表达量。

2　结果

2.1各组细胞中Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表达比较B、D组细胞中Smad2、Smad3、Smad7 mRNA相对表达量高于A组，C组细胞中Smad7 mRNA相对表达量高于A组(P均<0.05)。详见表1。

表1　各组细胞中Smad2、Smad3、Smad7 mRNA相对表达量比较±s)

注：与A组比较，*P<0.05。

2.2各组细胞中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白表达比较C组、D组细胞中p-Smad2、p-Smad3蛋白相对表达量低于A组，Smad7蛋白相对表达量高于A组(P均<0.05)。B组细胞中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白相对表达量均高于A组(P均<0.05)。详见表2。

表2　各组细胞中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白相对表达量比较

注：与A组比较，*P<0.05。

3　讨论

肝纤维化是多种细胞因子和多条信号通路共同作用的结果，其中关键细胞因子和信号通路所诱导的HSCs激活在肝纤维化过程中发挥重要作用[7]。TGF-β是公认的主要的致纤维化因子，共有三种亚型，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。其中TGF-β1是作用最强的促HSCs增殖及胶原产生的因子，在肝脏中含量最高[8]。Kupffer细胞、肝胆管细胞和浸润的炎症细胞都可以分泌TGF-β1，但HSCs细胞自分泌是TGF-β1最主要的来源[9]。TGF-β1/Smad信号通路是TGF-β1介导的最主要的信号通路。KLFs是一类具有锌指结构的转录因子家族，包含CX2CX3FX5LX2HX3H这个与DNA结合的极端保守序列。到目前为止，KLFs家族已经发现了至少25个成员。KLF4是其重要成员，在细胞增殖、分化及凋亡等方面发挥重要的调节作用[10,11]。已有研究[12]显示，KLF4可以调节TGF-β1在肌成纤维细胞中的表达。目前已知肝纤维化过程中一个重要特征是新合成的ECM增加速度超过了ECM的降解速度。实际上，肝纤维化的本质就是由于ECM合成与降解不平衡导致ECM过度沉积，而TGF-β1在ECM的降解以及合成等方面发挥着重要作用，是目前公认的最重要的致纤维化因子。KLF4可以影响TGF-β1的表达，故我们推测KLF4可能通过TGF-β1/Smad信号通路，在肝纤维化发生发展中发挥重要作用。

Smad蛋白是由许多转录因子构成的超家族，在脊椎动物、昆虫及线虫体内都有发现[13]。目前为止，Smad蛋白是TGF-β1受体惟一的底物[14]。在TGF-β1信号转导过程中，TGF-βⅡ型受体首先被激活，TGF-β1与TGF-βⅡ型受体组成激活复合体，导致TGF-βⅠ型受体激活，后者可特异性识别Smad蛋白，然后磷酸化Smad2和Smad3，它们与Smad4组成异聚体，从细胞膜进入细胞核，然后与靶基因的特定部位结合，启动相关基因的表达[15,16]。如引起胶原过表达，过多胶原沉积到肝组织，最终引起肝纤维化。在此过程中，Smad7可抑制TGF-β1介导的Smad2、Smad3磷酸化，阻止它们与Smad4结合，起到负向调节TGF-β1/Smad信号通路的作用[17]。目前抗肝纤维化的治疗策略之一是通过减少Smad2、Smad3磷酸化和上调Smad7表达来抑制TGF-β1/Smad信号通路活化。Latella等[18]研究表明，通过干扰Smad3的表达，可以减轻二甲基亚硝胺(DMN)导致的大鼠肝纤维化。相反，如果抑制Smad7的表达，可加剧大鼠的肝纤维化和肝损伤。Zhou等[19]用紫杉醇作用于大鼠HSC-T6细胞，发现HSC-T6的Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达减少，p-Smad2和p-Smad3表达减少，推测抗纤维化作用可能与之有关。Lee等[20]用低分子量肝素作用于DMN导致的肝纤维化大鼠模型，发现肝星状细胞中p-Smad2和p-Smad3表达减少，肝纤维化程度减轻。

我们设计了针对大鼠KLF4基因的干扰序列，并将其插入含U6启动子的pGPU6/GFP/Neo表达质粒，构建RNA干扰重组体，筛选出了干扰效果较好的pGPU6-3重组质粒。我们将pGPU6-3重组质粒用于KLF4基因沉默，观察TGF-β1/Smad信号通路相关分子的表达变化，结果显示，B、D组细胞中Smad2、Smad3、Smad7 mRNA相对表达量高于A组，C组细胞中Smad7 mRNA相对表达量高于A组，C组、D组细胞中p-Smad2、p-Smad3蛋白相对表达量低于A组，Smad7蛋白相对表达量高于A组，B组细胞中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad7蛋白相对表达量均高于A组，上述结果提示，KLF4基因沉默后，HSC-T6细胞中p-Smad2、p-Smad3蛋白表达下调，Smad7 mRNA及蛋白表达上调；对于TGF-β1激活的HSC-T6，也有同样的作用。我们推测，抑制KLF4基因表达可能有抗纤维化作用，作用机制与抑制TGF-β1/Smad信号通路激活有关。

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Effects of silencing KLF4 on Smad2, 3 and 7 mRNA and protein in rat hepatic stellate cells

LITao1，NIULijuan，LIUWenxuan，YANGLei，LIMan，CAODandan，LIUDianwu

( 1SchoolofPublicHealth,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

ObjectiveTo detect the effects of silencing Kruppel-like factor 4 (KLF4) gene on the Smad 2, 3 and 7 mRNA and protein expression of rat hepatic stellate cells HSC-T6. MethodsThree plasmids (pGPU6-1, pGPU6-2 and pGPU6-3) targeting KLF4 mRNA were designed. The chosen pGPU6-3 with the best silencing effects was infected into rat HSC-T6 cells and experiments were performed. HSC-T6 cells were divided into four groups: groups A, B, C and D. In group A, cells were cultured in DMEM mediun. In group B, cells were cultured in DMEM medium and TGF-β1intervention solution to a final concentration of 50 ng/mL. In group C, HSC-T6 was transfected with interfering plasmid pGPU6-3. In group D, 50 ng/mL TGF-β1intervention solution was added after the transfection of interfering plamid pGPU6-3. Real-time PCR was used to measure the mRNA expression of Smad2, Smad3 and Smad7 in HSC-T6 cells. The protein expression of Smad2, phosphorylated p-Smad2, Smad3, phosphorylated p-Smad3 and Smad7 was detected in HSCs-T6 cells by Western blotting. ResultsThe relative expression levels of Smad2, Smad3 and Smad7 mRNA in the groups B and D were higher than those in the group A, and the relative expression level of Smad7 mRNA in the group C was higher than that in the group A (allP<0.05). The relative expression levels of p-Smad2 and p-Smad3 protein in groups C and D were lower than those in the group A, and the relative expression level of Smad7 protein was higher than that in the group A (allP<0.05). The relative expression levels of Smad2, p-Smad2, Smad3, p-Smad3 and Smad7 protein in group B were higher than those in the group A( allP<0.05). Conclusions After KLF4 silencing, the expression of Smad2 and Smad3 in HSC-T6 cells was down-regulated and the protein expression of Smad7 was up-regulated. Inhibiting the KLF4 gene expression may have anti-fibrosis effect, and its mechanism may be related with the inhibition of TGF-β1/Smad signaling pathway activation.

Kruppel-like foctor4; hepatic stellate cells; tumor necrosis factor-β1; Smad; gene silencing; hepatic fibrosis

河北省卫生和计划生育委员会医学科学研究重点课题计划项目(20150627)。

李涛(1977-)，男，博士，主要研究方向为慢性肝病的防治。E-mail： litao771018@163.com

简介：刘殿武(1955-)，男，教授，博士生导师，主要研究方向为肝病分子流行病学。E-mail： liudwhb@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.007

R575.2

A

1002-266X(2016)31-0024-04

2016-04-28)