唑来膦酸对结肠癌细胞株CT26增殖、凋亡的影响及其机制探讨

朱劲华，张威，刘美辉，刘元芬，李佳慧，张奕婷，王勇

(1江苏建康职业学院临床与护理学院，南京211800；2南京大学金陵学院化学与生命科学学院；3南京大学江苏省医学分子技术重点实验室)



·论著·

唑来膦酸对结肠癌细胞株CT26增殖、凋亡的影响及其机制探讨

朱劲华1，张威1，刘美辉1，刘元芬1，李佳慧2，张奕婷3，王勇3

(1江苏建康职业学院临床与护理学院，南京211800；2南京大学金陵学院化学与生命科学学院；3南京大学江苏省医学分子技术重点实验室)

目的观察唑来膦酸(ZOL)对结肠癌细胞株CT26增殖、凋亡及Caspase-3、p53蛋白表达的影响。方法①ZOL对CT26细胞增殖的影响观察：将CT26细胞分为对照组和实验组，实验组细胞分别加入1、20、50、120、150、250 μmol/L的ZOL，对照组不加ZOL，采用MTS法测算细胞增殖率。②ZOL对CT26细胞凋亡的影响观察：加入终浓度分别为0、1、10、100、200、300 μmol/L的ZOL孵育CT26细胞24 h，采用流式细胞术测算细胞凋亡率。③ZOL对CT26细胞中Caspase-3、p53蛋白表达的影响观察：将CT26细胞分为实验组与对照组，实验组加入终浓度为200 μmol/L的ZOL，对照组不加ZOL，分别于12、24、36、48 h后采用Western blotting法检测Caspase-3、p53蛋白。结果1、20、50、120、150、250 μmol/L的ZOL处理CT26细胞后，细胞增殖率分别为83%、68%、65%、61%、59%、55%，20、50、120、150、250 μmol/L组与1 μmol/L组相比，P均<0.05。0、1、10、100、200、300 μmol/L的ZOL作用后，CT26细胞凋亡率分别为9%、23.06%、23.73%、26.12%、27.15%，1、10、100、200、300 μmol/L组与0 μmol/L组相比，P均<0.05；实验组加药36、48 h后，细胞中Caspase-3、p53蛋白相对表达量高于对照组(P均<0.05)。结论ZOL可抑制结肠癌细胞存活，促进其凋亡，作用机制可能与上调Caspase-3、p53蛋白表达有关。

唑来膦酸；结肠癌；结肠癌细胞；细胞增殖；细胞凋亡；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3；p53蛋白

唑来磷酸(ZOL)主要应用于治疗骨质疏松症、变形性骨炎、恶性肿瘤骨转移等引起的高钙血症和骨痛症等[1～5]。近年研究[6～10]发现，ZOL不仅可以减轻肺癌、乳腺癌、肾细胞癌、前列腺癌骨转移瘤导致的疼痛，减少骨质破坏，还可延长患者的生存期。结肠癌发生发展过程与细胞的恶性转变及过度增殖有关，也受细胞凋亡减少的影响。Caspase-3是细胞凋亡的关键蛋白酶[11]。研究[12]表明，Caspase-3和p53在大肠癌发生、发展中发挥一定作用，与大肠癌患者的预后有关。本研究选用结肠癌细胞株CT26制作体外肿瘤模型，观察ZOL对CT26细胞增殖、凋亡及Caspase-3、p53蛋白表达的影响，旨在探讨ZOL的体外抗肿瘤作用机制。

1　材料与方法

1.1细胞、材料与仪器人结肠癌细胞株CT26(美国模式培养物集存库)培养于DMEM培养基(含10%胎牛血清、链霉素100 μmol/L，青霉素100 U/mL)，置于5% CO2、37 ℃、饱和湿度的培养箱中培养至对数生长期；唑来膦酸，Annexin-V FITC和PI双染试剂盒，胰蛋白酶，PBS缓冲液，10×binding buffer，medium(含FBS)，裂解液，蛋白上样缓冲液；超净工作台，离心机，37 ℃培养箱，倒置显微镜，细胞计数板，6孔板，96孔板，酶联免疫检测仪，流式细胞仪，SDS-PAGE电泳仪，电泳槽，转膜仪，摇床，成像仪等。

1.2ZOL对CT26细胞增殖的影响观察取对数生长期的CT26细胞(8×103/mL)，按每孔100 μL接种到96孔培养板中，将细胞分为对照组和实验组。对照组加入100 μL的培养液；实验组细胞加入终浓度分别为1、20、50、120、150、250 μmol/L的ZOL；另设1个空白组，无细胞，仅加200 μL的培养液。每组设10个复孔。培养24 h后用MTS法检测每孔吸光度值(OD值)。细胞增殖率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.3 ZOL对CT26细胞凋亡的影响观察加入终浓度分别为0、1、10、100、200、300 μmol/L孵育CT26细胞24 h，用含有EDTA的胰蛋白酶消化细胞获得单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤后，每管加入1×binding buffer重悬细胞；多聚甲醛固定，每管加入5 μL的Annexin-V FITC和500 μL的PI混匀，避光孵育15 min；以400 μL的1×binding buffer重悬细胞，流式细胞仪检测凋亡细胞。

1.4ZOL对CT26细胞中Caspase-3、p53蛋白表达的影响观察采用Western blotting法。将CT26细胞分为实验组与对照组，实验组加入终浓度为200 μmol/L的ZOL，对照组不加ZOL。分别于12、24、36、48 h后分离CT26细胞质，提取总蛋白。取20 μL的细胞质总蛋白上样于10% SDS-PAGE胶，转到PVDF膜；以BSA封闭1 h后割下条带，在膜上做标记，加入GAPDH和Caspase-3、p53一抗，孵育过夜，洗膜后孵育相应二抗；用ECL显色，曝光，计算蛋白相对表达量。

2　结果

2.1ZOL对CT26细胞增殖的影响1、20、50、120、150、250 μmol/L的ZOL处理CT26细胞后，细胞增殖率分别为83%、68%、65%、61%、59%、55%，随着ZOL作用浓度增高，细胞增殖率下降，其中20、50、120、150、250 μmol/L组与1 μmol/L组相比，P均<0.05。

2.2ZOL对CT26细胞凋亡的影响0、1、10、100、200、300 μmol/L的ZOL作用后，CT26细胞凋亡率分别为9%、23.06%、23.73%、26.12%、27.15%，随着ZOL作用浓度增高，细胞凋亡率上升，其中1、10、100、200、300 μmol/L组与0 μmol/L组相比，P均<0.05。

2.3ZOL对CT26细胞中Caspase-3、p53蛋白表达的影响实验组加药36、48 h后，细胞中Caspase-3、p53相对表达量高于对照组(P均<0.05)。详见表1。

表1　两组CT26细胞中Caspase-3、p53蛋白相对表达量比较

注：与对照组相比，*P<0.05。

3　讨论

ZOL能抑制因破骨活性增加导致的骨吸收，因其具有双磷酸盐结构，对骨具有较强的亲和力。但是，在肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤的临床治疗中，ZOL不仅可以减轻患者骨转移肿瘤导致的疼痛，减轻骨质破坏，还能延长患者的总生存期(OS)和无事件生存期(PFS)。对这一现象进行深入研究后，有学者发现ZOL在骨组织可通过抑制甲羟戊酸途径，阻滞细胞周期从而诱导破骨细胞和单核细胞前体细胞凋亡，达到抑制骨吸收的目的。而在肿瘤组织中，ZOL能阻断肿瘤细胞产生的各种刺激因子，诱导钙离子释放，减缓骨转移的发生和发展，还可诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，具有直接的体内外抗肿瘤作用。

本研究分别观察了ZOL对CT26细胞增殖、凋亡的影响，结果发现，随着ZOL作用浓度增高，细胞增殖率下降，其中20、50、120、150、250 μmol/L组低于1 μmol/L组；随着ZOL作用浓度增高，细胞凋亡率上升，其中1、10、100、200、300 μmol/L组高于0 μmol/L组。这提示不同浓度的ZOL均可抑制CT26存活并诱导其凋亡，且随着ZOL浓度增高，作用更明显。

肿瘤的发生、发展与细胞过度增殖和凋亡减少有关。目前已明确的细胞凋亡相关信号转导通路包括Fas/FasL通路、Caspase家族通路、细胞色素C信号转导通路和线粒体通路。在这些信号通路中，Caspase家族通路被认为是非常重要的。Caspase-3是Caspase家族最重要的成员，可以与许多不同的底物发生反应，是多种凋亡途径的共同下游效应部分。Caspase-3在许多组织和细胞中一般以非活性状态的酶原形式存在，受到多种凋亡信号刺激后，剪切成有活性的c-Caspase-3蛋白从而启动细胞凋亡[13]。p53基因在防止细胞过度增殖及保持DNA受损基因组的完整性上都有重要作用，其表达增加可直接引起细胞凋亡，也可通过调节其他凋亡相关基因表达，间接导致细胞凋亡[14～16]。为进一步研究ZOL抑制结肠癌细胞增殖、诱导凋亡的机制，我们观察了ZOL对CT26细胞中凋亡相关蛋白表达的影响，结果发现，实验组加药36、48 h后，细胞中Caspase-3、p53相对表达量高于同时点对照组，提示ZOL可能是通过调节凋亡相关蛋白Caspase-3、p53从而发挥促进细胞凋亡的作用，且这种作用可能呈时间依赖性。

结合上述研究结果，我们认为，ZOL在体外能有效抑制CT26细胞增殖，并诱导细胞凋亡，ZOL的抗肿瘤机制可能是通过激活p53/Caspase-3信号通路、促进结肠癌细胞凋亡实现的。关于ZOL能否作为治疗结肠癌的辅助药物及ZOL的作用机制仍需进一步研究。

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Effects of Zoledronic acid on proliferation and apoptosis of colon carcinoma CT26 cells and its possible mechanism

ZHUJinhua1,ZHANGWei,LIUMeihui,LIUYanfen,LIJiahui,ZHANGYiting,WANGYong

(1JiangSuJianKangVocationalCollege,Nanjing211800,China)

ObjectiveTo investigate the effects of bisphosphonate zoledronic acid (ZOL) on the proliferation and apoptosis of colon cancer cell line CT26 in vitro and its effect on Caspase-3 and p53 protein expression. Methods① the effect of ZOL on the proliferation of colon cancer cell line CT26: CT26 cells were divided into the control and experimental group. The different concentrations of ZOL (1, 20, 50, 120, 150, 250 μmol/L) were added into the experimental group, and no ZOL was added in the control group. The proliferation inhibitory rate of CT26 cells was detected by MTS Colorimetry. ② the effect of ZOL on the apoptosis of colon cancer cell line CT26: CT26 cells were hatched with different concentrations of ZOL (1, 10, 100, 200 and 300 μmol/L). The apoptosis of CT26 cells was detected by flow cytometry. ③ the effect of ZOL on Caspase-3 and p53 protein expression: CT26 Cells were divided into the control and experimental group. ZOL with concentration of 200 μmol/L was added into the experimental group, and no ZOL was added in the control group. Caspase-3 and p53 protein expression was detected by Western blotting at 12, 24, 36 and 48 h after treatment. ResultsThe proliferation rates of CT26 cells treated with different concentrations of ZOL (1, 20, 50, 120, 150 and 250 μmol/L) were 83%, 68%, 65%, 61%, 59% and 55% respectively. Significant difference was found between groups treated with 20, 50, 120, 150 and 250 μmol/L ZOL and group treated with 1 μmol/L (allP<0.05). The apoptosis rates of CT26 cells treated with 0, 1, 10, 100, 200 and 300 μmol/L ZOL were 9%, 23.06%, 23.73%, 26.12% and 27.15%, respectively. Significant difference was found between groups treated with 1, 10, 100, 200 and 300 μmol/L (allP<0.05). After 36 and 48 h, the relative expression of Caspase-3 and p53 protein in the experimental group was higher than that of the control group (allP<0.05). ConclusionZOL could inhibit the growth of CT26 cells and promote its apoptosis, whose mechanism may be related to the up-regulated expression of Caspase-3 and p53 protein.

colon carcinoma; colon cancer cells; cell proliferation; apoptosis; Caspase-3; p53

江苏省卫生厅科研项目(H201430)。

朱劲华(1973-)，女，副教授，硕士，主要研究方向为肿瘤药物研究与开发。E-mail: zhjh7312@163.com

简介：张威(1968-)，男，硕士研究生，副教授，主要研究方向为肿瘤药物研究与开发。E-mail： zydzw0810@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.001

R78

A

1002-266X(2016)31-0001-03

2016-03-30)