缺血预处理对止血带诱发肢体缺血再灌注损伤大鼠血浆内皮素的影响

张谢卓，闫斌，刘利国，哈斯鲁，伊力哈木·托合提

(新疆医科大学第二附属医院，乌鲁木齐 830063)



缺血预处理对止血带诱发肢体缺血再灌注损伤大鼠血浆内皮素的影响

张谢卓，闫斌，刘利国，哈斯鲁，伊力哈木·托合提

(新疆医科大学第二附属医院，乌鲁木齐 830063)

目的探讨止血带预处理后诱发肢体缺血再灌注损伤大鼠血浆内皮素(ET)的变化及缺血预处理对其的影响。方法 将60只体质量150～200 g健康SD大鼠(雌雄不限)编号后采用随机数字表法将其分为对照组和实验组，各30只。对照组未经过缺血预处理，于直接缺血2、3、4 h及恢复血流后第1、3、7、14天取血测定血浆ET水平；实验组在大腿根部应用气囊止血造成肢体缺血后，止血带放松10 min形成缺血预处理过程，反复3次，于第2天分别缺血2、3、4 h后及恢复血流后第1、3、7、14天取血测定血浆ET水平。结果 两组第1、3、7天同一处理时间血浆ET水平比较，P<0.05或<0.01；第14天两组缺血3 h血浆ET水平比较，P<0.01。实验组和对照组血浆ET水平在第1、3、7、14天内呈先递增后递减的趋势，且在第3天或者第7天时达峰值(P均<0.05)。实验组内第1、3、5、7天不同处理时间血浆ET水平比较，P<0.05或<0.01；对照组内第1、7天不同处理时间比较，P<0.05或<0.01。实验组缺血2、3、4 h后不同观察时间血浆ET水平比较，P均<0.01；对照组缺血2、3、4 h后不同观察时间比较，P均<0.01。结论 在大鼠肢体再灌注损伤时，血浆ET水平在第3～7天达到峰值；肢体缺血再灌注初期，缺血时间越长，体内的血浆ET水平越高。给予止血带预处理，可显著降低大鼠体内血浆ET水平。

缺血再灌注损伤；止血带；缺血预处理；内皮素

血浆内皮素(ET)是1998年由日本Yanagisawa发现的一种收缩血管的活性物质，局部血管损伤可引起应激反应，致血管内皮细胞和神经胶质细胞分泌和释放ET。因ET及其受体在心血管系统中广泛存在，所以血管损伤、血栓形成或梗死后血浆以及梗死组织局部ET水平明显升高[1,2]。肢体缺血再灌注导致脏器损伤是多机制、多途径介导的病理生理过程，血浆ET等炎性介质的过度释放可能只是其中一个方面[3～5]。近年有文献[6]从组织病理学角度报道了缺血预处理能有效防治缺血再灌注损伤，但缺血再灌注后血浆ET的水平变化情况、缺血预处理对血浆ET水平的影响以及缺血时间和血浆ET水平的关系却不明确。2014年12月～2015年3月，本文模拟临床上气囊止血带的应用方法，制作大鼠后肢缺血再灌注损伤模型，观察止血带诱发大鼠肢体缺血再灌注损伤时ET的变化及缺血预处理对其的影响。

1　材料与方法

1.1材料动物：健康SD大鼠60只，不分雌雄，体质量150～200 g。主要试剂及仪器：Rat ET ELisa Kit试剂盒(abcam公司；货号：201411；批号：E-30727)；酶标仪(bio-rad,xMarkTM)；微量移液器(单道移液器、多道移液器)(大龙医疗设备有限公司)；电热恒温培养箱(上海精宏试验设备有限公司；型号：DNP-9272 )；微量振荡器(金坛市医疗仪器厂；型号：MM-2)；高速冷冻离心机(上海力申科学仪器有限公司；型号：Neofuge 15R)。

1.2分组及模型制备采用随机数字表法将SD大鼠分为实验组和对照组各30只。实验组用1%戊巴比妥钠(25 mg/kg)行腹腔麻醉，左后腿脱毛，在大腿根部应用特制的气囊止血带(长12 cm，宽2 cm)，充气压力为40 kPa，妥善固定10 min，造成肢体缺血后气囊止血带放松10 min，形成缺血再灌注预处理过程，反复3次，于次日各选10只再分别持续缺血2、3、4 h；对照组于次日各选10只分别直接持续缺血2、3、4 h。缺血后放松气囊止血带，恢复肢体血流。

1.3血浆ET的检测实验组和对照组依次于缺血2、3、4 h及恢复肢体血流(再灌注)后第1、3、7、14天时抽取血液，采用ELISA法测定大鼠血浆ET水平。

2　结果

实验组和对照组血浆ET水平在第1、3、7、14天内呈先递增后递减的趋势，且在第3天或者第7天时达峰值(P均<0.05)。实验组内第1、3、5、7天不同处理时间比较，F值分别为4.78、75.23、15.63、5.08，P<0.05或<0.01；对照组内第1、3、5、7天不同处理时间比较，F值分别为4.76、2.64、14.81、1.24，第1、7天不同处理时间比较，P<0.05或<0.01。实验组缺血2、3、4 h后不同观察时间比较，F值分别为47.25、501.06、35.16，P均<0.01。对照组缺血2、3、4 h后不同观察时间比较，F值分别为170.93、73.73、71.91，P均<0.01。详见表1。

表1　两组不同时间ET水平比较

注：与对照组同时间比较，*P<0.05，**P<0.01。

3　讨论

气囊止血带广泛应用于人工全膝关节置换术中，通过人为阻断血流达到减少出血及改善手术野的目的，同时也提高了骨水泥与假体界面的良好粘附，但四肢手术和血管损伤时气囊止血带的应用可能会导致肢体缺血再灌注损伤[1]，现阶段已经有大批的学者对止血带造成的肢体缺血再灌注损伤的机制以及防治措施进行了深入的研究，因为止血带的不恰当使用方法而造成的肢体缺血再灌注损伤的实质主要是机体产生的大量氧自由基对组织造成了损害[7]。为了防治这种损害，临床上常采用间歇性再灌注，即应用止血带1.5～2 h后放松止血带10～15 min。有文献报道，此种方法虽然可以减轻骨骼肌的缺血再灌注损伤，但骨骼肌的肌电图在术后半年内仍可持续存在改变[8]。近年来，主要以动物实验为主的关于肢体缺血再灌注损伤的研究较多。Murry等[9]在犬心脏缺血试验中首先提出短暂反复的缺血及再灌注并不会叠加再灌注的损伤，而会提高组织对缺血缺氧的耐受性，这种现象被称为是缺血预处理的保护作用。

在此次实验研究中，无论实验组还是对照组，血浆ET的水平均呈先递增后递减的趋势，且在第3天或者第7天时达峰值。胡跃林等[6]的实验从病理学角度出发，研究也得到了类似的结果，即不论大鼠有没有接受缺血预处理，在肢体缺血再灌注损伤后的第3天，大鼠骨骼肌病理改变最为显著。与此同时，研究发现实验组血浆ET水平在第1、3、7、14天显著低于对照组；仅在第7天实验组中止血2 h和止血3 h的大鼠血浆ET水平高于对照组；在第14天实验组中止血2 h的大鼠血浆ET水平低于对照组，但无统计学意义；在第14天实验组中止血4 h的大鼠血浆ET水平高于对照组，无统计学意义。表明给予止血带预处理，可显著降低大鼠体内血浆ET水平，印证了Murry等[9]提出的缺血预处理的保护作用，但并不是止血带预处理时间越长，保护作用就越强，随着止血带使用时间超过某个时间点，缺血预处理的保护作用就会显著降低甚至失效，有实验[10]证明骨骼肌的这个缺血时间节点为5 h。除此之外，我们还发现,实验组及对照组第1天大鼠血浆ET水平随着止血带止血时间延长有增高趋势，而在第3、7、14天大鼠血浆ET水平与止血带止血时间无明显规律。这说明在肢体缺血再灌注的初期，缺血时间越长，体内的血浆ET水平越高，而随着缺血时间的推移，大鼠血浆ET水平逐渐趋于正常而无明显规律。Brumback等[11]指出伴随着缺血损伤时间的延长，骨骼肌的代谢由有氧慢慢转变为无氧，从而减少了乳酸向丙酮酸的转化，大量乳酸产生堆积，容易增加组织中H+的水平，造成酸中毒。缺血时间越长，骨骼肌的损伤就越显著，因为缺氧造成的骨骼肌损伤引起ATP消耗、Na+-Ca2+交换体和Na+-K+泵功能异常及钙离子内流，这增强了细胞蛋白酶和肌球蛋白、肌动蛋白和游离钙的相互作用，骨骼肌纤维坏死是其最终的结果。

早在1856年，Virchow 就提出下肢深静脉血栓形成的三大因素是血管壁损伤、血流缓慢以及血液高凝状态。Blann等[12]对Virchow三要素重新解读以后认为，血管内皮细胞的损伤、血小板黏附聚集和可溶性凝血因子的激活是血栓形成的新三要素，可见血管内皮细胞在血栓形成的机制中起重要作用。血浆ET可以直接反映血管内皮细胞受损情况。肢体缺血再灌注时，血管内皮细胞损伤和血管内皮功能障碍一直存在，并对细胞和实质脏器损伤产生间接的影响，通过缺血预处理后，血浆ET水平显著降低，可以减少下肢深静脉血栓形成的诱因，有效地预防下肢深静脉血栓。

已有研究[13]表明预处理确实能减轻肢体缺血再灌注损伤，多年来，大量的研究也力求通过药物或者非药物干预来启动内源性脏器保护功能，进而减轻组织器官的缺血再灌注损伤。在非药物干预中，缺血预处理被认为是一种能有效地保护相关组织器官缺血再灌注损伤的方法，本实验通过测定血浆ET水平的方法也证实了止血带缺血预处理在一定条件下能够显著减轻肢体缺血再灌注损伤，降低下肢深静脉血栓形成的概率。

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Effects of ischemic preconditioning on plasma endothelin in rats with tourniquet-induced limb ischemia reperfusion injury

ZHANGXiezhuo,YANBin,LIULiguo,HASilu,YilihamuTuoheti

(SecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830063,China)

Objective To observe the changes of plasma endothelin (ET) in rats with tourniquet-induced limb ischemia reperfusion injury and the effects of ischemic preconditioning on it. MethodsSixty SD rats (male and female, 150-200 g) were randomly divided into the control group and the experimental group, each group with 30 rats. Rats in the control group did not receive ischemic preconditioning and just received ischemia for 2, 3 and 4 h, and on day 1, 3, 7 and 14, we took the blood and tested ET level of rats. In the experimental group, after the ischemic preconditioning, on the second day, rats underwent ischemia for 2, 3 and 4 h, and on day 1, 3, 7 and 14, we took the blood and tested ET level of rats. ResultsSignificant difference was found in the plasma ET levels between the two groups on day 1, 3 and 7 at the same processing time,P<0.05 orP<0.01. Significant difference was found in the plasma ET level between the two groups on day 14 at ischemia 3 h,P<0.01. In the experimental group and control group, the plasma ET levels in 1, 3, 7 and 14 days first increased and then decreased, and on day 3 or day 7, it reached the peak (allP<0.05). In the experimental group, significant difference was found in the plasma ET level on day 1, 3, 5 and 7 of different processing time,P<0.05 orP<0.01; in the control group, significant difference was found in the plasma ET level on day 1and 7 of different processing time,P<0.05 orP<0.01. In the experimental group after ischemia for 2, 3 and 4 h, significant difference was found in the plasma ET level when we compared the different observation time, allP<0.01. In the control group after ischemia for 2, 3 and 4 h, significant difference was found in the plasma ET level when we compared the different observation time, allP<0.01.ConclusionsWhen the reperfusion injury was induced, the plasma ET of rats reached the peak at the third to seventh day. In the initial stage of limb ischemia reperfusion, the plasma ET level in the blood became higher as the prolonged ischemia time. Ischemic preconditioning could significantly reduce the plasma ET level.

ischemia reperfusion injury; tourniquet; ischemic preconditioning; endothelin

新疆医科大学2013年科研创新基金项目(XJC201368)。

张谢卓(1991-)，男，硕士，主要研究方向为运动医学。E-mail:zhangxiezhuo123@126.com

简介：伊力哈木·托合提(1969-)，男，博士，主任医师，主要研究方向为运动医学及肩肘损伤。E-mail:tuohetiy@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.29.007

R364.1

A

1002-266X(2016)29-0021-03

2016-05-09)