贝那普利对糖尿病肾病大鼠肾脏五聚素-3表达及相关因素的影响

叶　茂，汪长华，张　敏

1.武汉大学基础医学院(湖北 武汉 430071) 2.恩施自治州中心医院(湖北 恩施 445000)



贝那普利对糖尿病肾病大鼠肾脏五聚素-3表达及相关因素的影响

叶茂1,2，汪长华1，张敏2

1.武汉大学基础医学院(湖北 武汉 430071) 2.恩施自治州中心医院(湖北 恩施 445000)

目的研究糖尿病肾病(DN)大鼠肾组织五聚素-3(PTX3)的表达情况及贝那普利对其影响。方法33只雄性Wistar大鼠建立DN模型后，随机分为3组：正常对照组(NC组)﹑糖尿病肾病组(DN组)﹑贝那普利组(BE组)，每组11只，BE组给予贝那普利10 mg/(kg·d)灌胃，NC和DN组以等量蒸馏水灌胃，1次/d，连用12周，之后检测血糖、糖化血红蛋白、肾重指数、尿微量白蛋白排泄率、肾组织PTX3的表达。结果12周末，DM组大鼠肾组织中PTX3表达明显高于NC组(P<0.01)，BE组的表达显著低于DM组，高于NC组(P<0.01)；PTX3表达与尿白蛋白排泄率呈正相关(r=0.954,P<0.01)。结论PTX3表达在糖尿病大鼠肾组织中明显增加，抑制蛋白尿表达可减少PTX3的表达。

糖尿病肾病；盐酸贝那普利；五聚素-3

Katherine[1]提出把糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)看作一种由代谢紊乱引起的炎症性疾病。五聚素-3(pentraxin-3,PTX3)又叫肿瘤坏死因子刺激基因14(tumornecrosis factor-stimulated gene 14，TSG14)[2]，是一种急性期糖蛋白可溶性受体，通常扮演着调理素的角色。PTX3在血管内皮细胞和巨噬细胞上表达，因此它的水平可更加直接反映血管炎性状态。临床研究表明[3-4]PTX3水平的增加与心血管事件、慢性肾脏疾病相关。微量蛋白尿是DN最早的临床检验异常指标，同时也是内皮功能障碍与高循环炎症介质的强预测因子。尿蛋白的丢失程度预测显性肾病的进展速度。贝那普利为血管紧张素转换酶抑制剂，具有抗炎症和抗纤维化作用，对DN有良好的疗效[4]，广泛应用于临床。本研究旨在探讨贝那普利对糖尿病大鼠肾组织PTX3以及尿蛋白排泄率等的影响,为DN治疗、新药开发提供实验依据，现报道如下。

1　材料与方法

1.1动物模型建立与分组6周龄清洁级Wistar雄性大鼠(湖北省实验动物研究中心提供)随机分为3组：正常对照组(NC组)，糖尿病肾病组(DN组)，贝那普利组(BE组)。体质量(190±9)g，每组11只。按昼夜时程平衡饲料喂养，自由饮水，进食，经1周喂养适应后，测定血糖均正常。禁食12 h后，DN组和BE组一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)60 mg/kg，造糖尿病肾病模型，72 h后，鼠尾静脉采血测血糖≥16.7 mmol/L为建模成功，NC组用等量的柠檬酸缓冲液，给药方式相同，建模成功后的BE组大鼠给予盐酸贝那普利(北京诺华制药有限公司，10 mg/片，批号20030514)混悬液以10 mg/(kg·d)比例灌胃,每日1次，连用12周。NC组和DM组每天则给予等剂量蒸馏水灌胃。

1.2标本留取与测定12周末，处理前一天代谢笼收集24 h尿，检测尿微量白蛋白(广州丰华公司泰莱Ⅰ型时间分辨荧光免疫分析仪),计算尿白蛋白排泄率(尿微量白蛋白×尿量/24×60,UAER)。空腹12 h后，称重后给予10%水合氯醛(0.7 mg/kg)腹腔注射麻醉，快速心脏采血约2 mL，置于抗凝管检测血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)。取出双侧肾脏，称重后，计算肾重指数(肾质量/体质量,KWI)，取2 mm厚的肾组织，于10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成4 μm的切片，行过碘酸雪夫氏染色(PAS染色)和PTX3免疫组织化学染色。用免疫组织化学试剂盒SP法(其中兔抗大鼠PTX3多抗购自Abcam公司)，实验步骤严格按说明书操作。每张标本在高倍镜下(×400)采用双盲法随机选取5个阳性视野,用HPIAS-1 000高清晰度彩色病理图文报告分析系统进行定量分析,测定PTX3的平均光密度值。

2　结果

建模过程中，DM组中2只大鼠在饲养过程中死亡(死因不明)，BE组有1只在灌胃时突然死亡。

2.1各组大鼠血糖、HbA1c、KWI及尿生化指标比较DM组及BE组血糖、HbA1c较NC组显著增加(P<0.01)。BE与DM组血糖比较，差异无统计学意义(P>0.05)。DM、BE组大鼠的KWI、UAER均明显高于NC组(P<0.01)，同期BE组较DM组显著降低(P<0.01)，较NC组显著增加(P<0.01)，见表1。

表1　各组大鼠BG、HbA1c、KWI及UAER比较

注：与NC组比较，△:P<0.01；与DM组比较，﹡:P<0.01。

2.2肾组织PTX3免疫组织化学染色比较NC组肾小管上皮细胞胞浆、肾小球内皮细胞胞浆中分别只有少量的PTX3阳性表达或者不表达;DM组表达较NC组明显增高;BE组表达低于DM组(P<0.01),高于NC组(P<0.01)，见表2，图1。

2.3肾组织PTX3与尿蛋白排泄率相关分析在固定变量血糖的情况下，对糖尿病大鼠肾组织PTX3和尿微量白蛋白排泄率进行偏相关分析发现：PTX3水平与尿微量白蛋白排泄率呈明显正相关，Pearson相关系数r=0.931,P<0.01。

表2　各组大鼠PTX3平均密度值比较±s)

注：与NC组比较，△:P<0.01；与DM组比较，﹡:P<0.01。

注：A：NC组；B：BE组；C：DN组。图1　肾PTX3免疫组化染色(SP×200)

3　讨论

PTX3属于五聚体蛋白超家族，目前被视为典型的炎症急性期反应蛋白，是由于一些主要炎症信号的刺激而产生的，如TLR受体激动剂，白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子(TNF-α)。此外，不同类型的细胞一旦暴露于适当的刺激就会产生PTX3。长链PTX3主要由树突状细胞、单核/巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、神经胶质细胞、卵丘细胞、肾小球系膜、细胞和滑膜细胞，甚至淋巴管内皮细胞等分泌和激活。在白细胞介素-1(IL-1)、TNF-α、白细胞介素-6(IL-6)作用下分泌的组织原型长链Pentraxin分子，可能更直接反应血管的炎症状态。Gustin C等[5]发现，在动脉粥样硬化中，血管内皮细胞受氧化修饰(ox)LDL(特别是溶血磷脂酸)作用后，通过溶血磷脂酸受体1，溶血磷脂酸受体3介导，通过NF-kB途径，促使内皮细胞合成PTX3，使单核细胞趋化、聚集，参与炎症过程。

微量蛋白尿是DN最早的临床检验异常指标，同时也是内皮功能障碍与高循环炎症介质的强预测因子。Naoto Katakami等[6]检测了78例1型糖尿病患者血浆PTX3水平，尿微量白蛋白排泄率以及颈动脉内膜厚度，发现PTX3不仅与颈动脉最大内膜厚度显著相关，同时也是DN指标尿微量蛋白排泄率的独立危险因素，得出PTX3水平与动脉粥样硬化的进展和1型糖尿病患者逐渐增加蛋白尿相关这一结论。同样是糖尿病微血管病变，Hyun Seung Yang等[7]研究发现DR的进展与糖尿病的病程(P=0.014)以及PTX3(P=0.025)的水平显著相关，得出血浆PTX3水平有可能与DR的发生、发展相关。Suliman等[8]报道207例慢性肾脏病5期需要透析患者和79例土耳其2型糖尿病并蛋白尿，肾功能正常患者检测PTX3水平与蛋白尿以及内皮功能的关系，发现2型糖尿病患者PTX3水平较对照组显著增加。在2型糖尿病并蛋白尿，肾功能正常患者蛋白尿与PTX3水平，CRP和HbA1c，INS，HOMA-IR呈正相关。并且，糖尿病早期CKD患者中，PTX3与24 h尿蛋白排泄率独立相关，从而得出PTX3与蛋白尿是独立相关的。并且2型糖尿病患者中，PTX3和蛋白尿均与内皮功能障碍相关这一结论。这与本实验结果是一致的，NC组只有少量的PTX3阳性表达或者不表达，DM组表达显著增加。

肾脏局部的肾素血管紧张素醛固酮系统(RAAS)是肾脏血流动力学的调节激素，也是导致肾病和心血管疾病的关键因素。病理情况下，RAA激活肾脏炎症与纤维化过程。临床和实验动物研究发现，血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)有抗炎和抗纤维化作用，从而减轻DN，保护肾脏。孔敏等[9]报道，对DN大鼠应用贝那普利干预治疗后可减少糖尿病大鼠尿蛋白排泄，足细胞恢复减轻肾脏损害，其机制可能是上调了nephrin RNA的表达，从而维护足细胞结构和分子成分，延缓DKD的进展。Yilmazd等[10]发现，在2型糖尿病并1期慢性肾脏疾病患者，雷米普利治疗12周后血清PTX3，CRP，血清白蛋白和蛋白尿水平显著下降，血流介导的舒张功能显著增加，说明短期ACEI治疗后，血清PTX3，CRP，血清白蛋白和蛋白尿水平显著下降。减少蛋白尿的水平能减少促炎因子PTX3的分泌，并改善内皮功能。本研究结果显示，糖尿病大鼠肾组织PTX3活性增加，与尿微量白蛋白增加呈正相关(r=0.931,P<0.01)。贝那普利干预后，PTX3的表达水平明显下降，肾脏病变也明显减轻，尿微量白蛋白的表达也明显下降。说明贝那普利可通过减少PTX3表达，降低了肾组织尿微量白蛋白的排泄，从而保护了肾脏。这与Yilmazd等[10]的实验结果是一致的。虽然本研究提示抑制蛋白尿表达可减少PTX3的表达，但其作用机制尚不明确，需要进一步研究。

[1]Katherine R，Tuttle B.Linking Metabolism and Immunology：Diabetic Nephropathy and Inflammatory Disease[J].J Am Soc Nephrol,2005,16(6):1 537.

[2]Lee GW,Goodman AR,Lee TH,et al.Relationship of TSG-14 protein to the pentraxin family of major acute phase proteins[J].J Immunol,1994,153(8):3 700-3 707.

[3]Marijn M Speeckaert,Reinhart Speeckaert,Juan J Carrero,et al.Biology of Human Pentraxin 3(PTX3)in Acute and Chronic Kidney Disease[J].J Clin Immunol,2013,33(5):881-890,893.

[4]Ruth Dubin,Yongmei Li,Joachim H Ix,et al.Associations of pentraxin-3 with cardiovascuar events,incident heart failure,and mortality among persons with coronary heart disease:date from the heart and soul study[J].American Heart Journal,2012,163(2),273-279.

[5]Gustin C,Delaive E,Dieu M,et al.Upregulation of pentraxin-3 in human endothelial cells after lysophosphatidic acid exposure[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008,28(3):491-497.

[6]Naoto Katakami,Hideaki Kaneto,Fumie Sakamoto,et al.Plasma pentraxin 3 levels are associated with carotid IMT in type 1 diabetic patients[J].Diabetes Research and Clinical Practice,2013,99(2):185-191.

[7]Hyun Seung Yang,Jong Eun Woo,Sung Ju Lee,et al.Elevated Plasma Pentraxin 3 Levels Are Associated With Development and Progression of Diabetic Retinopathy in Korean Patients With Type 2 Diabetes Mellitus[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2014,55(9):5 989-5 997.

[8]Mohamed E Suliman,Mahmut I Yilmaz,Juan J Carrero,et al.Novel Links between the Long Pentraxin 3,Endothelial Dysfunction,and Albuminuria in Early and Advanced Chronic Kidney Disease[J].Clin J Am Soc Nephrol,2008,3(4):976-985.

[9]孔敏,任伟,王艳,等.盐酸贝那普利对糖尿病大鼠肾脏足细胞及其蛋白nephrin表达的影响[J].中国临床保健杂志,2012,15(1):43-46.

[10]Mahmut Ilker Yilmaz,Jonas Axelsson,Alper Sonmez,et al.Effect of Renin Angiotensin System Blockade on Pentraxin 3 Levels in Type-2 Diabetic Patients With proteinuria[J].Clin J Am Soc Nephrol,2009,4(3):535-541.

责任编辑：艾茜

Effects of Benazepril Hydrochloride on the Expressions of PTX3 and Related Factors in the Kidney of DN Rats

Ye Mao1,2，Wang Changhua1，Zhang Min2

(1.BasicMedicalScienceSchoolofWuhanUniversity，Wuhan430071，China;2.TheCentralHospitalofEnshiAutonomousPrefecture,Enshi445000,China)

Objective To investigate the expressions of PTX3 in the kidney of Diabetic Nephropathy (DN) rats and the effects of Benazepril Hydrochloride on them.Methods After establishment of DN model，33 male Wistar rats were divided randomly into 3 groups:Normal control group (NC group),diabetic nephropathy group (DN group) and Benazepril Hydrochloride group (BE group),11 rats in each group.The BE group was given by lavage Benazepri,and the same volume of distilled water was lavaged to the two other groups.Twelve weeks later,Blood Glucose,Glycosylated Hemoglobin,kidney weight index, urinary albumin excretion and the expressions of PTX3 were measured.Results At the end of 12th week,the expressions of PTX3 in the DN group were significantly higher than those in the NC group(P<0.01)and the expressions in the BE group were lower significantly than those in the DN group,but significantly higher than those in the NC group(P<0.01).And the expressions of PTX3 showed a strong positive correlation with the level of Proteinuria(r=0.954,P<0.01).Conclusion In the renal tissue of Diabetic rats,the expressions of PTX3 significantly increased,and inhibiting the expressions of Proteinuria can decrease the expressions of PTX3.

diabetic nephropathy;benazepril nephropathy;PTX3

叶茂(1975- )，女，湖北恩施人，硕士在读，主任医师，研究方向：糖尿病及慢性并发症发病机制的研究。

R587.1

A

1008-8164(2016)03-0013-04

2016-07-10