O型、A型及Asia-1型口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

张彦婷，吴 楠，刘玉梅，王晓清，刘国民，陈超英

（1.金宇保灵生物药品有限公司，内蒙古 呼和浩特 010030；2.内蒙古呼和浩特市农牧业局，内蒙古 呼和浩特 010020）

O型、A型及Asia-1型口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

张彦婷1，吴 楠2，刘玉梅1，王晓清1，刘国民1，陈超英1

（1.金宇保灵生物药品有限公司，内蒙古 呼和浩特 010030；2.内蒙古呼和浩特市农牧业局，内蒙古 呼和浩特 010020）

根据口蹄疫病毒VP1基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计4条特异性引物，通过对退火温度等反应条件进行优化，建立能够同时扩增出O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒的多重RT-PCR检测方法。结果表明，建立的方法最低可以检测出约含1 pg/μL的病毒样品；该方法对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等其他相关病毒的检测结果均为阴性，特异性良好。建立的方法能够对口蹄疫O型、A型、Asia-1型病毒准确定型，可广泛用于口蹄疫病毒3个血清型的快速检测和分子流行病学调查。

口蹄疫O型病毒；口蹄疫A型病毒；口蹄疫Asia-1型病毒；多重RT-PCR

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起偶蹄动物发生的烈性传染病，可感染70多种家养或野生哺乳动物，并对动物养殖业造成非常严重的经济损失。其中猪和牛的临床表现最严重，羊表现亚临床感染。世界动物卫生组织（OIE）将口蹄疫列为A类动物传染病之首，我国农业部也将其列为一类重大动物疫病。

口蹄疫病毒属于小RNA病毒科，病毒含正链RNA基因组，编码病毒聚蛋白。其血清型复杂多变，自20世纪20年代在法国和德国发现O、A、C 3个不同的血清型后，20世纪40年代和50年代Pirbright研究所又确认了3个南非型SAT 1～3和Asia-1型共7个血清型［1］。口蹄疫病毒各血清型无交叉保护，又分很多拓扑型和基因型［2-4］。我国口蹄疫流行由来已久，疫情复杂，近年来我国周边的部分国家和地区连续发生口蹄疫［5］。2013年以来这些国家向OIE报告口蹄疫疫情33次，其中O型8次，A型25次。今后的防疫重点仍是O型和A型。Asia-1型虽然自2009年5月以来没有临床发病的报道，但也应引起足够的重视。

近年来，分子生物学在口蹄疫诊断中的应用越来越广泛，研究人员利用分子生物学技术建立了多种口蹄疫诊断技术。对口蹄疫病毒进行准确分型和遗传分析，是疫苗选择和防控措施制定的重要依据［6］。该研究旨在通过建立一种快速、灵敏度高、特异性好的区分口蹄疫病毒O型、A型、Asia-1型的RT-PCR检测方法，为口蹄疫防控措施的制定提供有力的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 病毒毒株与样本 口蹄疫病毒毒株JMS（O型）、OZK （O 型）、MYA98 （O 型）、WH09 （A 型）、GDMM（A 型）、JSL（Asia-1 型），由金宇保灵生物药品有限公司种毒室保存。猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等均来自商品试剂盒中的阳性对照。

1.2 主要试剂与设备 One Step PrimeScriptTMRTPCR Kit购自TaKaRa公司，凝胶回收试剂盒购自Thermo公司。MyCycler PCR仪为美国BIO-RAD公司产品，全自动凝胶成像仪购自北京原平皓生物技术公司，DXY-6C型电泳仪购自北京六一厂。

1.3 引物设计与合成 根据实验室保存的口蹄疫病毒O型、A型、Asia-1型VP1基因标准序列，利用Primer Premier 5.0软件设计3条特异性引物，O1：TCAAGCTCCACGTGTGAC，A1：AGCAAGTACTCGGCTCCT，As1：CCTGGAGGTTGCGAGTC，以 及 1条 共 用 引 物 M2：ATGTCCTCTTATCTGGTTC。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.4 病毒核酸的提取 取病毒液200 μL于1.5 mL离心管中，加1 mL Trizol裂解液裂解10～15 min。加200 μL氯仿，静置离心后取上清液与等量异丙醇混合，静置离心。用75%乙醇沉淀，晾干后用20 μL DEPC水溶解，用于RT-PCR扩增。

1.5 RT-PCR扩增 以提取的O型、A型、Asia-1型口蹄疫病毒的RNA为模板，加入One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit试剂盒试剂中，与引物O1、A1、As1、M2 进行扩增， 以 DEPC 水为阴性对照。 采用 25 μL 反应体系：Enzyme Mix 1 μL，2×Buffer 12.5 μL， 模板 2 μL，4 条引物各 0.25 μL，补DEPC水至25μL。多次试验后确定扩增条件为：95℃3 min；94 ℃20 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果，胶回收片段送测序公司测序。

1.6 特异性试验 用1.4中介绍的方法分别提取猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒的核酸，以1.5中介绍的方法进行RT-PCR扩增，以DEPC水为阴性对照，评价该方法的特异性。

1.7 敏感性试验 对用146S方法检测出的病毒含量为10 ng/μL左右的口蹄疫Asia-1型病毒液作10倍连续稀释，提取每个稀释度病毒RNA作为模板进行RT-PCR检测。能检出最大稀释倍数对应的病毒含量即为该方法最小检出量，以此来评价该方法的敏感性。

1.8 重复性试验 重复提取口蹄疫O型JMS、MYA98、OZK 株，A 型 WH09、GDMM 株，Asia-1 型JSL株病毒进行RT-PCR检测，观察该方法的稳定性和重复性。

2 结果与分析

图1 多重RT-PCR扩增产物电泳结果

2.1 RT-PCR方法的建立 由图1可知，口蹄疫病毒O型JMS、OZK、MYA98株分别扩增出约200 bp大小片段，A型 WH09、GDMM株分别扩增出约300 bp大小片段，Asia-1型JSL株扩增出约500 bp大小片段。DEPC水阴性对照没有扩增出条带。

对扩增出的核酸片段切胶回收，送测序公司测序。结果表明，O型、A型、Asia-1型的扩增产物分别是 176、284、464 bp。经与 GenBank中已知序列进行比较，O型MYA98株序列与GenBank中MYA/3/2000 株（Sequence ID：gb/HQ632768.1）序列的相似性为99%，A型毒株序列与GenBank中A/VN/20/2009 株（Sequence ID：gb/GQ406252.1）序列的相似性为99%，Asia-1型毒株序列与GenBank中Asia-1/HN/2006 株（Sequence ID：gb/KC412634.1）序列的相似性为99%。

2.2 特异性试验结果 由图2可知，以口蹄疫病毒O型JMS株、A型WH09株、Asia-1型JSL株的RNA为模板，均扩增出相应条带，检测结果为阳性；以DEPC水和猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒的核酸为模板，均未扩增出任何条带，检测结果为阴性。

图2 多重RT-PCR特异性试验结果

2.3 敏感性试验结果 以蔗糖梯度离心法检测出口蹄疫Asia-1型病毒 （JSL株）146S含量为10ng/μL的病毒液作为母液，进行10倍连续稀释。提取不同稀释度病毒液的RNA，以其为模板进行RT-PCR扩增。由图3可知，第5个稀释度（第6泳道）可以扩增出相应条带，即该方法最小检出量为1 pg/μL。

图3 多重RT-PCR敏感性试验电泳结果

2.4 重复性试验结果 提取口蹄疫病毒O型JMS、MYA98、OZK 株，A 型 WH09、GDMM 株，Asia-1型JSL株病毒RNA，作为模板重复进行RT-PCR检测。结果均扩增出相应大小的目的条带，检测结果为阳性。说明该方法重复性和稳定性较好。

3 讨论

口蹄疫一年四季均可发生，但秋冬季最为严重。各种家养和野生偶蹄动物对口蹄疫病毒均易感，引发疾病的严重程度因免疫程度、感染病毒量、病毒毒株和动物种类而不同，其发病的严重程度在同种动物的不同个体间也有差异。目前对口蹄疫还没有特异性治疗方法，仍以疫苗免疫为主。口蹄疫病毒有7个血清型，各型之间均无交叉免疫性，型内各毒株之间有明显的抗原差异，预防口蹄疫等于预防7种病或多种病，只使用1种血清型的疫苗对其他6种血清型病毒是没有保护作用的。因此，快速准确的诊断对口蹄疫的科学防控具有指导意义。快速准确地区分口蹄疫病毒的血清型，可以为疫苗的选择和防控措施的制定提供理论依据，从而将口蹄疫危害降到最低。该研究建立的RT-PCR方法能够在3 h内完成对口蹄疫病毒O型、A型、Asia-1型的准确分型，具有操作简单、准确性好、灵敏度高等特点，对口蹄疫病毒血清型的快速诊断具有重要意义，可以为疫苗的选择及流行病学调查提供有利的技术支撑，具有广阔的应用前景。

［1］索布林那，多明戈.口蹄疫现状与未来［M］.朱彩珠，张强，卢永干，译.北京：中国农业科学技术出版社，2009.

［2］KNOWLES N J，SAMUEL A R，DAVIES P R，et al.Pandemic strain of foot-and-mouth disease virus serotype O［J］.Emerg Infect Dis，2005，11（12）：1887-1893.

［3］VALARCHER J F，KNOWLES N J，ZAKHAROV V，et al.Multiple origins of foot-and-mouth disease virus serotype Asia 1 outbreaks，2003-2007 ［J］.Emerg Infect Dis，2009，15（7）：1046-1051.

［4］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京：科学出版社，1997.

［5］谢庆阁.口蹄疫［M］.北京：中国农业出版社，2004.

［6］SAMULE A R，KNOWLES N J.Foot-and-mouth disease type O viruses exhibit genetically and geographically distinct evolutionary lineages （topotypes） ［J］.J Gen Virol，2001，82（3）：609-621.

Establishment of a Multiplex RT-PCR for Simultaneous Detection of FMDV Serotypes O,A and Asia-1

ZHANG Yan-ting1，WU Nan2，LIU Yu-mei1，WANG Xiao-qing1，LIU Guo-min1，CHEN Chao-ying1
（1.The Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co.，Ltd.，Hohhot 010030，China；2.Hohhot Municipal Bureau of Agriculture and Animal Husbandry of Inner Mongolia，Hohhot 010020，China）

The aim of the present study was to develop a multiplex RT-PCR for simultaneous detection of FMDV serotypes O,A and Asia-1.Four specific primers were designed by Primer Premier 5.0 Software targeting VP1 gene of FMDV.The annealing temperature and other reaction conditions were optimized.The results showed that the detection limit of the established method was 1 pg/μL;the detection results of CSFV,PPV,PRV,PRRSV,PCV and other related virus by using the developed method was all negative,indicating the good specificity of the method.FMDV serotypes O,A and Asia-1 could be accurately discriminated by the multiplex RT-PCR method developed in this study which was suitable for rapid detection and molecular epidemiological survey of the three serotype of FMDV.

FMDV serotype O；FMDV serotype A；FMDV serotype Asia-1；multiplex RT-PCR

S854.43；S855.3

A文章顺序编号：1672-5190（2016）12-0009-03

2016－11－19

张彦婷（1972—），女，兽医师，硕士，主要从事动物疾病监测工作。

刘玉梅（1978—），女，高级兽医师，主要从事动物疾病监测工作。

（责任编辑：赵俊利）