RNA干扰SOST基因对成骨细胞的影响

杨国安，王玉林，王宏坤，庞春艳 （包头医学院第一附属医院中心实验室，内蒙古包头014010）

·基础与转化医学·

RNA干扰SOST基因对成骨细胞的影响

杨国安，王玉林，王宏坤，庞春艳 （包头医学院第一附属医院中心实验室，内蒙古包头014010）

【Abstract】AIM：To investigate the possibility of siRNA in SOST treatment of osteoporosis（OP）by using siRNA interference to silence the SOST gene.METHODS：The experiment objects were divided into control group，empty vector group，SOST-siRNA1 group and SOST-siRNA2 group.The successfully established 10 μg SOST-siRNA1 and SOST-siRNAs vector were respectively transfected by lipofectin transfection with rat osteoblasts and the empty vector group was transfected with the same dose of hairpin DNA empty vector.24 h，48 h，72 h and 96 h after transfection，with the inverted fluorescence microscope，the transfection efficiency was observed；with RFPCR，levels of SOST.mRNA in osteoblasts in four groups，and the ELISA method was used to detect the four groups in cell supernatant alkaline phosphatase and type I collagen expression level changes.RESULTS：The plasmid vector of SOST-siRNA was successfully constructed，the expression of SOST-mRNA was inhibited，and the expression of type I collagen was improved.CONCLUSION：After inhibition of the the expression of SOST-mRNA，the expression of type I collagen can be improved，and it can also promote the development of osteoblasts，suggesting that it has a certain therapeutic effect on OP.

【Keywords】siRNA；interference；SOST gene；osteoblast type I collagen

目的：利用siRNA干扰技术沉默SOST基因，观察其对大鼠成骨细胞的影响，探讨SOST，siRNA治疗骨质疏松症（OP）的可能性.方法：实验分对照组、空载体组、SOST-siRNA1组及SOST-siRNA2组，将成功构建的10 μg SOST-siRNA1和SOST-siRNA2表达载体分别采用脂质体法转染大鼠成骨细胞，空载体组大鼠成骨细胞转染等剂量的pGFP-V-RS空载体.转染后24 h、48 h、72 h和96 h荧光倒置显微镜下观察细胞转染效率，实时荧光定量RT-PCR法检测4组大鼠成骨细胞中SOST-mRNA的表达水平，ELISA法检测4组细胞上清中碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白表达水平变化.结果：成功构建SOST-siRNA质粒载体，SOST-siRNA可以抑制大鼠成骨细胞中SOST-mRNA的表达；促进细胞上清中Ⅰ型胶原蛋白表达.结论：SOST-siRNA抑制大鼠成骨细胞中SOST-mRNA的表达后，可以促进细胞上清中Ⅰ型胶原蛋白表达，同时促进成骨细胞的发育，提示其对OP有一定的治疗作用.

siRNA；干扰；SOST基因；成骨细胞；Ⅰ型胶原蛋白

0　引言

骨质疏松症是以骨量降低及骨微结构退变为特征的一种系统性骨病.在我国随着老年人口的增加，其发病率处于上升趋势.成骨细胞主要参与骨基质的合成、分泌和矿化，是骨形成的主要功能细胞.骨重建（bone remodeling）是骨组织形态和密度不断发生改变的现象，骨代谢过程中破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质和蛋白酶溶解消化矿物质和骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，继而矿化而形成新骨.破骨与成骨是一个动态平衡过程，是人体维持正常骨量的关键.成骨细胞骨形成功能的减退和/或破骨细胞骨吸收作用的增强可造成骨质疏松，因此通过激素和细胞因子调节这两类细胞的数目和活性使骨量维持动态平衡.可缓解骨质疏松.

人类sost基因于2001年被发现，存在于人类染色体17q12-21，编码由骨细胞分泌抑制成骨的硬化蛋白［1］.SOST是一种糖蛋白，含213个氨基酸，带有1个用于分泌的信号序列、6个保守的半胱氨酸残基、1个保守的甘氨酸残基和2个N-糖基化位点，属于“胱氨酸结（cystine-knot）”的分泌型蛋白 DAN家族［2］.能抑制成骨细胞的增值与分化［3］，其表达异常与骨质疏松症和骨硬化症的发病关联密切.本研究采用siRNA技术沉默大鼠sost的表达，探讨SOST-siRNA表达载体对sost的沉默效果和ALP、I型胶原蛋白表达水平的影响.

1　材料与方法

1.1主要试剂 载体pGFP-V-RS（武汉析码公司），TRIzol（日本Takara公司），AxyPrep质粒DNA大量抽提试剂盒（美国Axygen公司），M-MLV逆转录酶和脂质体 lipofectamineTM 2000（美国 Invotrigen公司），ELISA试剂盒为RD国内分装试剂盒（上海生工生物工程有限责任公司）.

1.2siRNA的设计 本实验针对目的基因（sost）的cDNA序列设计2段siRNA.第1段序列为：GACGTGTCCGAGTACAGCT，第2段序列为：GCCGGTCACCGAGTTGGT.将上述序列的模板插入质粒载体pGFP-V-RS，构建真核表达载体.

1.3分组及各项指标检测 实验分为四组，即对照组、空载体组、SOST-siRNA1组和SOST-siRNA2.取成功构建的SOST-siRNA1和SOST-siRNA2真核表达载体2μg与脂质体 lipofectamine TM 2000的混合物［DNA（μg）：lipofectamineTM 2000（μL）为1：3］分别转染SOST-siRNA1组和SOST-siRNA2组中的大鼠成骨细胞，对照组转染等剂量空载体与lipofectamine TM2000的混合物.转染48h后，TRIzol法提取细胞总RNA，采用TAKARA公司的反转录试剂盒进行反转录，RT-PCR法检测细胞中SOST-mRNA的表达，并根据Ct值计算2-ΔΔCt.PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸40 s，30个循环，72℃再延伸10 min.ELISA检测细胞上清中细胞因子ALP和I型胶原蛋白的变化，根据标准曲线计算出ALP和I型胶原蛋白的浓度.

1.4统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，以±s表示ALT和I型胶原蛋白的浓度值及SOST-mRNA的表达水平，组间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义.

2　结果

2.1SOST的siRNA真核表达载体的构建 成功构建了sost的siRNA真核表达载体，并送Invotrigen公司进行DNA基因测序分析，结果显示sost的两段siRNA序列已完整无误的插入质粒载体pGFP-V-RS中.

sost的 siRNA真核表达载体和空载体转染后24 h、48 h、72 h和96 h荧光显微镜下观察细胞绿色荧光，结果显示转染后 48 h绿色荧光最亮最多（图1），即细胞转染效率最高.

图1　细胞转染效率

2.24组细胞中SOSF-mRNA表达水平 SOSF-siRNA转染成骨细胞48 h后，siRNA1组和siRNA2组SOST-mRNA的表达明显低于对照组和空载体组，差异有统计学意义（P＜0.05），对照组和空载体组比较差异无统计学意义（P＞0.05），siRNA1组和siRNA2组比较差异有统计学意义（P＜0.05，表1）.

表1　4组细胞中SOST-mRNA表达水平　（±s）

表1　4组细胞中SOST-mRNA表达水平　（±s）

aP＜0.05 vs对照组；cP＜0.05 vs空载体组；eP＜0.05 vs siRNA2组.

分组　2-ΔΔCt对照组　1.00±0.00空载体组　0.75±0.07 siRNA1组　0.07±0.03acesiRNA2组　0.02±0.01ac

2.3ALP和I型胶原蛋白的表达 细胞转染48 h后，siRNA1组和siRNA2组细胞上清中ALP的浓度高于对照组和空载体组，但差异无统计学意义（P＞0.05），4组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；siRNA1组和siRNA2组细胞上清中的COL I浓度高于对照组和空载体组，差异有统计学意义（P＜0.05），对照组和空载体组比较差异无统计学意义（P＞0.05），siRNA1组和siRNA2组比较差异无统计学意义（P＞0.05，表2）.

表2　4组细胞上清中ALP、COL I表达水平 （±s，pg/mL）

表2　4组细胞上清中ALP、COL I表达水平 （±s，pg/mL）

aP＜0.05 vs对照组；cP＜0.05 vs空载体组.

分组　ALP　COL I对照组　0.26±4.12　0.33±6.66空载体组　0.24±5.74　0.42±6.65 siRNA1组　0.30±5.13　0.79±7.57acsiRNA2组　0.29±7.20　0.81±9.85ac

3　讨论

sost基因位于人类染色体17q12-21，其表达产物骨硬化蛋白Sclerostin为含有213个氨基酸的糖蛋白，SOST-mRNA在心脏、主动脉、肝脏以及肾脏都有表达，但只有在骨组织中表达骨硬化蛋白.骨质疏松症的危害：可降低患者的生活质量，脊柱变形、骨折可致残，使患者活动受限、生活不能自理，增加肺部感染、褥疮发生率，给个人、家庭和社会带来沉重的经济负担.成骨细胞在骨形成过程中要经历成骨细胞增殖，细胞外基质成熟、矿化和凋亡四个阶段.骨细胞数量增加，进而合成并分泌Ⅰ型胶原以便最终可以矿化形成骨结节.早期研究发现其主要生物学功能是通过与骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）受体竞争性结合，而减弱BMP信号作用，进而抑制成骨细胞的生成［4］.近年来研究证实，Sclerostin并非一种经典的BMP通路拮抗剂，其对骨形成的负性调控作用主要与 Wnt/β-catenin信号通路有关［5］.它通过与受体LRP5/6结合，抑制Wnt/β-catenin链蛋白信号通路，调节骨的代谢，从而抑制骨形成.在敲除大鼠 sclerostin基因后，大鼠模型骨量明显增加［6］，用SOST蛋白单克隆抗体处理过的大鼠，骨密度和强度显著增加.因此抑制SOST的表达为治疗骨质疏松提供了新的思路［7］.

RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是基因功能组学研究的有效手段，具有高效性、特异性和放大作用等优点，广泛用于肿瘤［8］、自身免疫性疾病［9］等疾病的研究.主要有由于DNA修饰或染色体异染色质化等造成的转录前水平沉默（TGS）以及细胞质内靶mRNA序列特异性降解的转录后水平沉默（PTGS）两类.Pauley等［10］将caspase-3的siRNA序列和M3受体激动剂胆碱连接，转染HSG细胞，可以明显的抑制caspase-3在基因和蛋白水平的表达.Yu等［11］构建TNF-α siRNA的腺病毒载体注射小鼠，可有效沉默小鼠假体周围组织中的TNF-α的表达，从而抑制骨溶解.

本研究成功构建两段siRNA真核表达载体，并转染大鼠成骨细胞.与对照组比较均对SOST-mRNA起到了抑制表达的作用，实验设计的第二段siRNA序列抑制SOST-mRNA的表达作用强于第一段siRNA序列，差异有统计学意义.

两段siRNA对成骨细胞ALP的浓度无明显作用，但对I型胶原的产生起到了催进作用，因此从细胞水平上提示SOST-siRNA可作为抑制sost基因表达的一种方法［12-15］，为基因治疗骨质疏松症提供部分实验室依据.

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Effect on osteoblast of SOST gene silencing by siRNA interference

YANG Guo-An，WANG Yu-Lin，WANG Hong-Kun，PANG Chun-Yan
Central Lab of First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou 014010，China

R681

A

2095-6894（2016）07-06-03

2016-06-06；接受日期：2016-06-20

2013年包头市医药卫生基金项目（基金编号：wsjj2013083）

杨国安.硕士，副主任检验师.研究方向：多基因遗传病. Tel：0314-5689431 E-mail：0331004@163.com