基于超高效合相色谱对黄芪中5种主要黄酮类化合物的快速检测

王波 周围 刘小花 柳小亚 陈亚丽 封士兰

摘要：建立了利用超高效合相色谱法（Ultra performance convergence chromatography，UPC2）快速分离和测定黄芪中5种主要黄酮类化合物（毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美的紫檀素、芒柄花苷、芒柄花素）的方法。黄芪样品采用80%乙醇提取后，以超临界CO20.2% H3PO4甲醇溶液为流动相，梯度洗脱，色谱柱为Waters ACQUITY UPC2 CSH柱（100 mm × 3.0 mm，1.8 μm），柱温为40℃，流速为0.4 mL/min，进样量为1 μL，检测波长为280 nm。整个分析过程仅需15 min，分析速度是传统液相色谱的3倍以上。结果表明：毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美的紫檀素、芒柄花苷与芒柄花素的检出限及定量限范围分别在0.3～0.5 mg/kg和1.0～2.0 mg/kg之间，5种黄酮类成分的加标平均回收率均高于99.7%，相对标准偏差（RSD）小于2.2%（n=6）；在最优条件下，对13批不同产地的黄芪进行检测，毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美的紫檀素、芒柄花苷与芒柄花素的含量范围分别在4.8～102 mg/kg、14～277 mg/kg、0～135 mg/kg、5.3～119 mg/kg及2.8～41 mg/kg之间；本方法简便快速，重复性良好，结果准确可靠，可用于黄芪药材中5种主要黄酮类成分的含量测定。

关键词 ：超高效合相色谱； 黄酮类； 黄芪

1 引 言

超高效合相色谱法（Ultra performance convergence chromatography，UPC2）是超高效液相色谱（UPLC）和超临界流体色谱（Supercritical fluid chromatography，SFC）技术的结合，它以超临界流体二氧化碳为流动相主体，依靠流动相的溶剂化能力进行分离与分析[1，2]。相对于传统超临界流体色谱重复性较差的缺点，UPC2能够通过精确调节流动相强度、压力和温度，在整个分离过程中获得较好的重现性；此外，由于CO2超临界流体具有较高的线速度及较低的密度，在分离过程中具有很高的柱效，且分析速度快，灵敏度高，有机溶剂使用量少。此外，CO2可与多数极性和非极性有机溶剂混溶，与气相色谱（Gas chromatography，GC）相比，超临界流体具有类似于液体的密度，为常压气体的200～500倍，具有较高的溶解能力，适于分离难挥发和热不稳定性物质，而气相色谱需将样品气化后才能进行分离操作，不适合于难挥发及热不稳定物质的分离；与液相色谱（Liquid chromatography，LC）相比，超临界流体具有较小的粘度，可减小过程阻力，在相同条件下，压力降比液相色谱的低，并且具有较高的扩散系数和传质速率，在分离操作时所用的时间短，单位时间内分离效能高[3～5]。

黄芪为常用补气药，《中华人民共和国药典》2010年版一部载黄芪为豆料植物膜荚黄芪（Astragalus membranaceus （Fisch）.Bge）或蒙古黄芪（A. membranaceus （Fisch ）Bgevar.mongholicus （Bge） Hsiao）的干燥根，其味甘，性温，归肺、脾经；具有补气固表、敛疮生肌等作用，临床用于气虚乏力，表虚自汗，气虚水肿，慢性肾炎蛋白尿和糖尿病等症[6]。研究表明，黄酮类成分作为其有效成分之一，有抗菌抗病毒、降血脂、抗氧自由基等作用，还具有抗缺血和改善血象作用[7～9]。

近年对黄酮类成分含量测定方面的报道较多，常见的为高效液相色谱法[10～12]，薄层色谱法[13～15]，液相色谱串联质谱法[16～19]等，对于液相色谱质谱法，因为仪器的价格昂贵，在国内还未被普遍使用；层析色谱及高效液相色谱法特异性不强，干扰物质较多、定量不准确，分析时间长，不能用于多种物质的同时测定。本研究采用超高效合相色譜法同时测定黄芪中5种主要黄酮类化合物，在15 min内实现了5种黄酮类化合物的分离。实验表明，本方法快速准确、灵敏度高、重复性好、实用性强，为黄芪中5种主要黄酮类化合物的定性与定量检测提供了一种高效可行的色谱检测方法。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

超高效合相色谱仪（美国Waters公司），配有Waters EmpowerTM 3数据处理系统；3K30冷冻离心机（美国Sigma公司）；MS3涡旋仪（德国IKA公司）；移液枪（美国Thermo Electron公司，100～1000 μL、1.0～5.0 mL）。

毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美的紫檀素、芒柄花苷、芒柄花素（纯度>98.5%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）；CO2（纯度>99.997%，兰州汇能公司）；甲醇、乙腈、异丙醇、正己烷（色谱纯，德国Merck KGaA公司）；其余试剂均为分析纯。

根据黄芪药材的不同来源，将其依次编为1～13号，样品均在产地购买，原植物由兰州医学院生药植物室马志刚副教授鉴定为多序岩黄芪Hedysarum polybolrys HandMazz，均为栽培品。

2.2 标准贮备液配制

称取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美的紫檀素、芒柄花苷和芒柄花素适量，用甲醇溶解并定容至100 mL，分别配制成含100 mg/L毛蕊异黄酮、130 mg/L毛蕊异黄酮苷、236 mg/L美的紫檀素、206 mg/L芒柄花苷和232 mg/L芒柄花素的标准储备液，4℃下冷藏待用。

2.3 色谱条件

Waters Acquity UPC2 CSH Fluorophenyl色谱柱：（100 mm×3.0 mm， 1.8 μm）；流动相：A为CO2， B为甲醇；流速0.4 mL/min；进样量：1 μL；柱温30℃；检测波长280 nm；动态背压（Active back pressure regulator，ABPR）：11.72 MPa。梯度洗脱程序见表1。

2.4 样品的制备

准确称取粉碎后的黄芪样品2.00 g于50 mL聚乙烯管中，加入30 mL 80%乙醇溶液，涡旋2 min混匀后，超声提取30 min，重复提取2次，合并提取液，于80℃下减压浓缩至近干，残渣用乙醇定容至5 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，经超高效合相色谱分析，外标法定量。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件优化

3.1.1 色谱柱的选择

为了使黄芪中5种主要的黄酮类物质在较短分析时间达到分离并具有良好峰形，比较了Acquity UPC2 BEH 2EP（150 mm×2.1 mm i.d.， 1.7 μm）、Acquity UPC2 HSS C18 SB（100 mm×3.0 mm i.d.， 1.8 μm）、Acquity UPC2 BEH（150 mm×2.1 mm i.d.， 1.7 μm）和Acquity UPC2 CSH Fluorophenyl（100 mm×3.0 mm i.d.， 1.8 μm）这4款常见的色谱柱对5种主要黄酮类物质的分离影响（图1）。由图1可知，4种色谱柱均能很好地将5种黄酮类物质进行分离，但是使用BEH 2EP柱（图1C）时，美迪紫檀素和芒柄花素出峰时间均较晚， 且芒柄花苷峰型不对称，分离效果不理想；当使用HSS C18 SB柱和BEH柱时（图1B和1D），虽然5种黄酮类物质均能达到分离要求，但是，对于HSS C18 SB柱，芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷之间分离度较小，同样，对于BEH柱，美迪紫檀素和芒柄花素之间分离度较小，在实际样品检测中，受到了未知物的干扰，影响定量分析准确性。而使用CSH Fluorophenyl柱时，5种黄酮类物质在12 min内出峰完全，且峰形尖锐，相互之间无影响。因此，本研究选择Acquity UPC2 CSH Fluorophenyl色谱柱进行分离。

3.1.2 流速的选择 由于超临界CO2流体具有的较低的粘度和较高的扩散系数，使得超临界流体作为流动相在分离过程中则具有较高的线速度；流动相的流速越大，被分离物质出峰时间越快，峰型尖锐；较小的流速会造成分析时间过长，色谱峰展宽，影响检测的灵敏度。本实验使用超高效合相色谱，对流速进行优化，考虑到助溶剂的加入和系统最高压力的限制，流速在0.3～1.0 mL/min范围内进行优化，当流速为0.3 mL/min时，分离时间长达18 min，不能做到快速、高通量分析，并且芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷拖尾严重，影响定量分析的准确性及灵敏度。当流速大于0.6 mL/min时，由于梯度洗脱时间延长，助溶剂比例增加，系统压力可能会超出最高压力，为了保证较好的灵敏度、系统压力以及目标物尽可能与杂质分离，本实验的最佳流速选择为0.4 mL/min。

3.1.3 助溶剂的选择

由于UPC2的流动相主要是CO2超临界流体，助溶剂的加入会使超临界流体的溶剂化能力增强，从而使流动相对目标物的溶解性增大，能够极大地改善目标化合物的峰形及保留时间，为了调整流动相的溶剂化能力，实验中通常加入甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇等助溶剂，有效改变目标化合物的峰形及保留时间。本实验分别选用了甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈4种常用的不同极性的助溶剂，对黄芪中5种主要黄酮类物质进行分离。结果表明，随着助溶剂极性增大，流动相的溶解能力也相应增强，使得5种黄酮类物质出峰时间改变。在分别使用乙醇和异丙醇为助溶剂时，美迪紫檀素出峰时间提前，且由于乙醇和异丙醇的极性较小，芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷在流动相中的溶解能力降低，出现较为严重的色谱峰拖尾；使用乙腈作为助溶剂时，由于流动相具有较低的溶剂化能力，使得芒柄花苷和毛蕊异黄酮苷色谱峰拖尾严重。当选用甲醇为助溶剂时，5种黄酮类物质在较短时间内达到较好分离，并具有较好的峰型，因此，本实验選择甲醇为助溶剂。

3.1.4 动态背压（ABPR）的选择

超高效合相色谱中，动态背压（ABPR）控制CO2在整个操作过程中的超临界流体状态， 是影响分离过程的重要因素之一。不同的动态背压下，CO2超临界流体对各种样品有着不同的溶解能力。当背压升高时，超临界流体密度增大，溶剂化能力增强，柱压升高，分析物保留时间提前。本实验在10.31～14.48 MPa范围内考察了CO2超临界流体对样品分离度的影响。结果表明，随着背压增大，CO2超临界流体密度及黏度随之增加，柱压升高；当背压为10.31 MPa时，5种黄酮类物质虽然得到较好分离，但是分析时间较长，达到了17 min；当背压高于13.1 MPa时，系统压力已超过最高压力的80%。综合考虑动态背压及系统压力，当背压为11.72 MPa时，5种黄酮类物质之间分离情况最好，保留时间适中、峰形对称，故本实验选择动态背压为11.72 MPa。

3.1.5 色谱柱温度的选择

随着温度升高，超临界流体的黏度降低，溶剂化能力减小，使得目标物出峰时间延长；随着温度降低，超临界流体黏度增加，溶剂化能力增强，目标物出峰时间相应的缩短，这与传统的液相色谱相反。为了使样品中5种黄酮类物质得到较好分离，本实验在保持其它色谱条件不变的前提下，在30℃～70℃范围内考察了柱温对目标物分离的影响（图2）。结果表明，随着温度升高，黄酮类物质的保留时间逐渐延长，当温度为40℃时，目标物均得到分离； 当温度逐渐升高时，目标物的出峰时间延长，分离度减小，其中所含杂质易干扰目标物。因此，本实验选择最佳分离温度为40℃。

3.1.6 提取溶剂及提取条件的选择

为了尽可能多且完全地提取黄芪中的有效成分，本实验分别以50%～90%甲醇以及50%～90%乙醇对黄芪药材进行超声提取。结果表明，80%乙醇超声提取，黄芪提取液中5种主要黄酮类物质的相对含量最多。本研究同样考察了提取时间和提取次数对提取效率（峰面积）的影响。结果表明，30 mL 80%乙醇提取两次，每次30 min，提取效率最高。

3.2 方法学考察

3.2.1 稳定性实验 取黄芪样品，按照2.4节处理样品，分别在2.3节所述色谱条件下进样分析 0， 4， 12， 24和48 h，黄芪中的美迪紫檀素、芒柄花素、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷的峰面积RSD分别为0%， 0.5%， 0.5%， 0.7%和0.8%。表明样品溶液在48 h内稳定。

3.2.2 专属性实验 取所得1号样品溶液、混合标准溶液、阴性供试品溶液，在2.3节所述的色谱条件下进样分析，将阴性样品与混合标准溶液色谱图和样品色谱图比较（图3），在5种黄酮类的出峰位置无干扰，表明本方法专属性好。

3.2.3 线性范围及定量限

分别量取5种黄酮类物质的对照品溶液1.0， 2.5， 5.0， 10.0， 20.0和50.0 mL，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到0.10～118.0 mg/g的系列溶液。在2.3节所述色谱条件下，每个浓度依次进样1.0 μL，以浓度（μg/mL）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归。由表2可见，5种黄酮类物质在一定范围内线性关系良好。

3.2.4 精密度实验

按照2.3节所述色谱条件，5种黄酮类物质标准溶液重复进样6次，日内精密度（RSD）在0.5%～0.8%之间；日间精密度（RSD）在0.5%～1.1%之间，可以看出本方法对检测黄芪中5种黄酮类物质具有较好的日间和日内精密度，可满足黄芪中5种主要黄酮类物质的检测要求。

3.2.5 重复性实验

准确称取同一黄芪样品（No.1）6份，按2.4节进行样品处理，在2.3節所述的色谱条件下进样分析，样品色谱图见图3， 5种黄酮类化合物的含量及相对标准偏差（RSD）计算结果见表3，同一份黄芪样品（No.1）中美迪紫檀素、芒柄花素、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷含量的RSD分别为1.3%， 2.6%， 2.7%， 2.7%， 2.2%。表明本方法重复性较好。

3.2.6 加标回收率 准确称取6份同一批（No.1）黄芪样品，准确加入5种被测组分混合标准品的乙醇溶液1 mL，按按2.4节进行样品处理，在2.3节所述的色谱条件下进样分析（表4），5种被测组分加样回收率在98.8%～103.5%之间，RSD在1.4%～2.1%之间，表明本方法准确可靠。

3.3 实际样品分析

取所收集的13批次黄芪样品（粉碎后过4号筛），准确称取2.00 g，按2.4节进行样品处理，在2.3节所述的色谱条件进样分析（表5）。部分黄芪样品色谱图见图4。

3.4 UPC2与HPLC对比分析

按2.5节进行样品处理，用Waters Alliance 2695高效液相色谱仪进样10 μL进行分析，流动相为甲醇0.2% H3PO4溶液，梯度洗脱，280 nm下检测。另取相同供试品溶液，用Waters 超高效合相色谱进样分析，进样量为1 μL，流动相为甲醇0.2% H3PO4溶液，梯度洗脱，280 nm下检测。分别得到1号黄芪样品的超高效合相色谱和高效液相色谱的色谱图，分别见图3及图5。由图5可见，超高效合相色谱法与高效液相色谱法相比，因为保留机理不同，5种黄酮类化合物在超高效合相色谱与高效液相色谱的分离过程中，出峰顺序完全相反，且高效液相色谱分析时间长达90 min，而超高效合相色谱分析时间较高效液相色谱缩短近4倍。由此可见，传统液相色谱方法相比，本实验建立的超高效合相色谱快速检测黄芪中5种主要黄酮类化合物方法即节省溶剂，降低检测成本，又能使分析物快速分离，实现高通量检测。

4 结 论

采用超高效合相色谱法同时测定了黄芪中的5种主要的黄酮类成分。本方法灵敏度高，重现性、稳定性良好，分析时间短，除平衡仪器所用的5 min外，完成一次分析仅15 min，分析速度比高效液相色谱快近4倍，可用于黄芪药材中黄酮类成分含量的高通量测定。采用本方法对13批不同来源的黄芪药材的5种主要黄酮类物质的含量进行测定，结果含量差异较大，这可能是由于药材的品种、产地、种植方式及气候等因素导致。

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Abstract A method was developed for the rapid separation and determination of 5 kinds flavonoids （calycosin， calycosin7OβDglucoside， ononin， medicarpin and formononetin） in Astragali Radix based on ultraperformance convergence chromatography. After extracting by 80% ethanol， the flavonoids were separated on a Waters Acquity UPC2 CSH （100 mm×3.0 mm i.d.， 1.8 μm） column at 40℃ by using supercritical CO2methanol （contain 0.2% H3PO4） acetonitrile as the mobile phase at a flow rate of 0.4 mL/min， and then analyzed by a UV detector at wavelength of 280 nm， the whole analysis progress was only 15 min. The results showed that the limits of detection （LOD） and the limits of quantitation （LOQ） of five flavonoids were between 0.3 and 0.5 mg/kg， and 1.0 and 2.0 mg/kg， respectively. The spiked recoveries were more than 99.7%， and the relative standard deviations （RSD） were less than 2.2% （n=6）. Under the optimal conditions， 13 groups of Astragali Radix from different producing areas were detected. The contents of calycosin， calycosin7OβDglucoside， medicarpin， ononin and formononetin were 4.8-102 mg/kg， 14-277 mg/kg， 0-135 mg/kg， and 5.3-119 mg/kg， 2.8-41 mg/kg， respectively. This method is simple， fast， accurate and reproducible， and the result is reliable. The method is applicable for the determination of 5 flavonoids in Astragali Radix.

Keywords Ultraperformance convergence chromatography； Flavonoids； Astragali Radix