在线凝胶渗透色谱—气相色谱—串联质谱非衍生化法测定食品中氯丙醇

易青 苗虹 吴永宁

摘要：建立了食品中氯丙醇类化合物的非衍生化在线凝胶渗透色谱气相色谱串联质谱（Online GPCGCMS/MS）测定方法，目标化合物包括3氯1，2丙二醇（3MCPD）、2氯1，3丙二醇（2MCPD）、1，3二氯2丙醇（1，3DCP）和2，3二氯1丙醇（2，3DCP）。样品中加入氘代同位素内标后，采用ExtrelutTM NT硅藻土进行固相支持液液萃取净化，用正己烷淋洗去除非极性杂质，以乙酸乙酯萃取目标物，萃取液经浓缩后直接采用Online GPCGCMS/MS测定。4种氯丙醇在0.005～1.000 mg/L范围内呈良好线性，相关系数均大于0.999，4种氯丙醇的检出限在0.002～0.005 mg/kg之间，定量限在0.005～0.01 mg/kg之间。以空白酱油样品为代表性基质的3个水平（0.02， 0.1和0.5 mg/kg ）的加标回收率和相对标准偏差（RSD， n=6）分别为94.8%～106.3%（2.2%～10.3%）， 91.8%～108.8%（2.1%～10.6%）和83.1%～109.4%（1.3%～9.4%）。采用本方法分别对酱油、水解植物蛋白液（粉）、料酒、鸡精、面包和糕点样品进行检测，均得到了满意的测定结果。

关键词 ：食品； 氯丙醇； 在线凝胶渗透色谱气相色谱串联质谱； 固相支持液液萃取净化； 非衍生化

1 引 言

氯丙醇类化合物（包括3MCPD， 2MCPD， 1，3DCP和2，3DCP）早期在于酸水解植物蛋白液及以其为原料的调味品（如酱油等）中发现[1～3]，之后又陆续在面包、香肠、咖啡、谷物类等食品中检出[4～8]。

毒理学研究表明，3MCPD可以通过血睾屏障和血脑屏障，并在体液中广泛分布，具有生殖、肾脏和神经毒性[9，10]。WHO/FAO食品添加剂和污染物联合专家委员会（JECFA）确定1，3DCP具有体外遗传毒性和生殖毒性，会引起大鼠肝、肾脏、甲状腺等的癌变[11]；2，3DCP會对肝、肾脏及精子产生影响[11]。

目前，食品中氯丙醇的检测通常采用七氟丁酰咪唑（HFBI）、七氟丁酰酐（HFBA）[12]、三氟乙酸酐（TFAA）[13]和苯硼酸[1]等衍生试剂将氯丙醇衍生，利用气相色谱质谱（GCMS或GCMS/MS）法进行测定[14～18]。我国食品安全国家标准 GB/T 5009.1912006《食品中氯丙醇含量的测定》中氯丙醇的测定采用的是以HFBI衍生化的GCMS方法[19]。在上述方法中，衍生化步骤繁冗复杂；衍生物稳定性较差，需衍生后尽快完成测定；衍生试剂昂贵，增加样品检测成本，并且对环境湿度要求极高，否则易吸潮变质。

Online GPCGCMS是将凝胶渗透色谱和GCMS在线联用的分析检测技术，能将样品净化液中分子量较大的脂类、色素等干扰物质与目标物分离，减少基质影响，降低分析背景，提高重现性，实现连续自动的部分前处理和仪器测定的在线分析，加快分析速度和提高分析结果的准确性。与GCMS相比，GCMS/MS将离子碎片施予适当能量再次打碎，形成二级离子碎片，增强了结构解析和定性能力，更有效地排除基质干扰。本研究建立了非衍生化的Online GPCGCMS/MS法直接测定食品中氯丙醇的检测方法，同时对食品样品的前处理方法进行了优化。本方法对样品的适用性广泛，不仅适用于调味品，也适用于面包、糕点等其它食品样品。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

Online GPCGCMS/MS系统（日本Shimadzu公司），GPC系统包括SIL20ADvp自动进样器、ShodexEV200AC凝胶渗透色谱柱（150 mm × 2 mm）、CTO20ASvp柱温箱、SPD20Avp紫外检测器；GCMS/MS系统包括QP2010Plus气相色谱仪、TQ8040型质谱联用仪，并配有PTV2010大体积进样器；MilliQ超纯水器（美国Millipore公司）；G560E型涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）；NEVAPTM111型吹氮浓缩仪（美国Organomation Associates公司）；G560E涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）；AL204分析天平（瑞士梅特勒公司）；NDO400型电热恒温鼓风干燥箱（杭州汇尔仪器设备有限公司）；微量移液器（德国Eppendorf公司）。

3MCPD（纯度98%，德国Aldrich公司）；五氘代3氯1，2丙二醇（D53MCPD，纯度≥99%，德国DrEhrenstorfer公司）；1，3DCP、2，3DCP、五氘代1，3二氯2丙醇（D51，3DCP）和五氘代2，3二氯1丙醇（D52，3DCP）（纯度≥97%，德国Fluka公司）；2MCPD、五氘代2氯1，3丙二醇（D52MCPD）（纯度≥98%，加拿大TRC公司）；正己烷、乙酸乙酯（色谱纯，美国J.T. Baker公司）；无水Na2SO4（优级纯，天津市津科精细化工研究所，使用前经195℃烘烤8 h使用）；ExtrelutTM NT硅藻土填料（德国Merck公司）。

2.2 标准溶液的配制

分别准确称取各氯丙醇和氘代氯丙醇标准品10 mg（精确至0.01 mg），用乙酸乙酯溶解并定容至不同的10 mL棕色容量瓶中，配制成1000 mg/L标准储备液，于20℃贮存。准确吸取各氯丙醇标准储备液， 用正己烷逐级稀释，配制成10 mg/L氯丙醇混合标准使用液。准确吸取各氘代氯丙醇标准储备液，用正己烷稀释，配制成10 mg/L氘代氯丙醇混合标准使用液。分别准确吸取适量氯丙醇标准使用液和适量氘代氯丙醇标准使用液， 用正己烷稀释，配制成0.01， 0.02， 0.05， 0.1， 0.2， 0.5和1.0 mg/L的氯丙醇系列混合标准工作液，其中氘代氯丙醇的含量均为0.2 mg/L。

2.3 实验方法

2.3.1 样品提取与净化 准确称取2 g试样于10 mL离心管中（若为固体或半固体试样，则加入2 mL水，溶解后混匀），加入10 mg/L氘代氯丙醇混合标准使用液20 μL，涡旋30 s，加入到填充了2 g ExtrelutTM NT硅藻土填料的塑料层析柱（180 mm × 150 mm）中，静置10 min，用3 mL正己烷淋洗，弃去流出液，以10 mL乙酸乙酯进行固相支持液液萃取，收集流出液至装有3 g无水Na2SO4的离心管中，充分吸收水分，转移上清液并于30℃以氮气吹至近干，用正己烷定容至1 mL，涡旋混匀，无水Na2SO4除水，待测。

2.3.2 Online GPCGCMS/MS条件 Online GPC条件：泵流速0.1 mL/min；柱温40℃；载气吹扫0.1 min； 流动相为丙酮环己烷（3∶7， V/V）。

气相色谱质谱条件： 气相色谱柱系统包括空柱（惰性石英管，5 m × 0.53 mm）、预柱（DB5MS石英毛细管柱，5 m × 0.25 mm × 0.25 μm）和分析柱（DB5MS石英毛细管柱，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）。进样体积：10 μL，不分流进样。进样口程序升温：120℃保持5 min，以100℃/min升至280℃，并恒温15.9 min。进样时间：7 min；柱温箱程序升温：82℃保持5 min，以8℃/min升至150℃，继续以25℃/min升至250℃，并保持5 min。载气：高纯氦气（纯度99.999%），流速为1.75 mL/min。离子源：电子轰击源，温度为200℃。溶剂延迟时间为10 min。采用多反应监测模式（MRM）扫描，主要质谱参数见表1。

3 结果与讨论

3.1 Online GPC收集时间考察

Online GPCGCMS/MS的原理是样品经Online GPC柱分离，废液通过六通阀排出，含有目标物的馏分先被储存在定量补集环路（200 μL）中，再全部注入GC，通过溶剂蒸汽出口排出溶剂，同时目标分析物保存在预柱中。待溶剂排出口关闭后柱，柱温箱开始升温，目标物进入分析柱分离，因此收集时间的选择显得尤为重要。配制0.5 mg/L氯丙醇混合标准溶液，重复进样5次，获得目标物在GPC上保留时间为3.99～ 4.05 min，考虑到灵敏度和基质去除效果，确定收集时间为3.80～4.25 min。氯丙醇及其内标混合标准溶液（0.2 mg/L）的MRM质谱图见图1， 各氯丙醇的色谱图见图2和图3。

3.2 样品净化方法的优化

文献 [20，21]利用ExtrelutTM NT硅藻土进行固相支持液液萃取净化，测定食用植物油中的氯丙醇，使提取液先吸附于硅藻土表面，经正己烷淋洗去除脂肪和色素后，以乙酸乙酯与吸附于硅藻土表面的氯丙醇进行液液萃取。本实验对乙酸乙酯溶剂（纯度≥99%）的用量（2， 4， 6， 8， 10和12 mL）进行了优化，结果见图4，当乙酸乙酯用量为10 mL时，各氯丙醇的峰面积响应值最高。因此，乙酸乙酯用量选择10 mL。

考虑到Online GPC的在线净化能力以及简化实验操作，比较了不经填料吸附直接进行液液萃取净化的传统方法与以ExtrelutTM NT硅藻土进行的固相支持液液萃取净化方法的效果，以空白酱油样品添加回收实验的方式（0.2 mg/L）测得4种氯丙醇的回收率分别为53.2%～81.2%和83.3%～110.1%。结果表明，以ExtrelutTM NT硅藻土进行的固相支持液液萃取净化的效果更好、准确度更高。

3.3 方法学验证

3.3.1 线性范围、检出限和定量限 以氯丙醇混合标准使用液及氯丙醇内标标准使用液配制浓度分别为0.005， 0.01， 0.02， 0.05， 0.1， 0.2， 0.5和1.0 mg/L（内标浓度均为0.2 mg/L）的氯丙醇系列标准工作液，经Online GPCGCMS/MS测定。以氯丙醇的色谱峰峰面积与其对应的内标的色谱峰峰面积之比（y）为纵坐标，氯丙醇与其对应内标的浓度之比（x）为横坐标，绘制标准工作曲线，结果见表2。4种氯丙醇在0.005～1.0 mg/L范围内呈现良好的线性关系，相关系数（R）均大于0.999。

在空白酱油样品中添加0.001， 0.002， 0.005和0.010 mg/L 4个水平的3MCPD， 2MCPD， 1，3DCP和2，3DCP标准样品。以3倍信噪比（S/N=3）所对应的含量作为方法的检出限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）所对应的含量作为方法的定量限（LOQ），得到氯丙醇类化合物的检出限在0.002～0.005 mg/kg之间， 定量限在0.005～0.01 mg/kg之间，结果见表2。与文献[19]报道的衍生化方法相比，本方法的检出限更低（表3）。

3.3.2准确度与精密度 以空白酱油加标回收率表示方法的准确度，以回收率的相对标准偏差（RSD）表示方法的精密度。在空白酱油样品中添加0.02， 0.1和0.5 mg/L的3MCPD， 2MCPD， 1，3DCP， 2，3DCP标准样品，每个加标水平平行测定6份，结果见表4。4种氯丙醇的3个水平加标回收率和相对标准偏差（RSD）分别为94.8%～106.3%（2.2%～10.3%）， 91.8%～108.8%（2.1%～10.6%）和83.1%～109.4%（1.3%～9.4%）。结果表明，方法的精密度和准确度良好。

3.4 实际样品分析

利用本方法对于北京地区超市、农贸市场及相关食品企业采集的78份食品样品（其中包括酱油20份、料酒16份、面包糕点21份、鸡精15份、水解植物蛋白液3份、水解植物蛋白粉3份）进行了检测，结果见表5。在检测的78份样品中，3MCPD的检出率最高，为100%（78/78），2MCPD的检出率为67.9%（53/78），1，3DCP和2，3DCP的检出率相对较低。依据食品安全国家标准GB27622012《食品中污染物限量》[22]对液态调味品和固态调味品中3MCPD的限量标准（0.4和1.0 mg/kg），酱油、水解植物蛋白液、水解植物蛋白粉、料酒、鸡精样品超标率依次为4/20， 2/3， 1/3， 2/16， 0/15。由样品检测结果可见，某些食品中氯丙醇污染水平仍然較高，因此有必要对食品中氯丙醇污染进行监测，并采取相应的监督管理措施。

4 结 论

结合固相支持液液萃取净化样品前处理技术，建立了无需衍生化反应的Online GPCGCMS/MS同时测定食品中氯丙醇的方法。通过线性实验、空白加标回收实验等方法学实验验证了方法的准确性。与传统的GCMS衍生化方法相比，本方法简便、快速、经济，适于食品中氯丙醇的检测。实际样品检测结果表明，不同食品中仍存在氯丙醇污染超过我国相关限量标准的现象，因此有必要加强监测及相应的监督管理措施。

References

1 Baer I， Calle B I， Taylor P. Anal. Bioanal Chem.， 2010， 396： 443-456

2 Velíek J， Davidek J， Hajlová J， Kubelka V， Janíek G， Mánková B. Zeitschrift Fur LebensmittelUntersuchung UndForschung， 1978， 167（4）： 241-244

3 Collier P D，Cromie D D O， Davies A P. J. Am. Oil Chem. Soc.， 1991， 68： 785-790

4 Anna R S， Ewa C. J. Verbr. Lebensm.， 2015， 10： 117-122

5 Belitz H D， Grosch W， Schieberle P. Food Chemistry. Berlin Heidelberg： Springer， 2009： 938-970

6 Dolezal M， Chaloupska M， Divinova V， Svejkovska B， Velisek J. Eur. Food Res. Technol， 2005， 221： 221-225

7 Svejkovska B， Novotny O， Divinova V， Reblova Z， Dolezal M， Velisek J. Czech J. Food Sci.， 2004， 22（5）： 190-196

8 Chung H Y， Chung S W C， Chan B T P， Ho YY， Xiao Y. Food Addit. Contam. A， 2013， 30（9）： 1508-1512

9 Jones A R， Chantrill L A. Reprod. Fert. Develop.， 1989， 1： 357-367

10 Hamlet C G， Sadd P A， Gray D A. J. Agric. Food Chem.， 2004， 52（7）： 2067-2072

11 JECFA. JECFA Monograph on the Safety Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants.， 2001

12 LI YongJun， HUANG ZhiQiang， DAI Hua. Chin. J. Anal. Lab.， 2003， 22（4）： 47-49

李拥军， 黄志强， 戴 华. 分析试验室， 2003， 22（4）： 47-49

13 LUO RenCai， JIN QingZhong， ZHANG Zheng， ZHOU Shan， LI Jie. Food Sci.， 2000， 21（7）： 36-37

罗仁才， 金庆中， 张 正， 周 珊， 李 洁. 食品科学， 2000， 21（7）： 36-37

14 FU WuSheng， WU YongNing， ZHAO YunFeng， MA JinBo， ZHANG Qi. Chin. J. Food Hyg.， 2004， （4）： 289-294

傅武胜， 吴永宁， 赵云峰， 马金波， 张 琦. 中国食品卫生杂志， 2004， （4）： 289-294

15 GAO Jie. Chin.Brew.， 2013， 32（9）： 145-147

高 洁. 中国酿造， 2013， 32（9）： 145-147

16 HUANG Qi， JI XiaoJuan， WANG DanDan. J. Zhejiang. Univer. Sci. Techn.， 2013， 25（1）： 33-37

黄 琦， 季晓娟， 王丹丹. 浙江科技学院学报， 2013， 25（1）： 33-37

17 XU XiaoMin， SHEN XiangHong， SONG GuoLiang. REN YiPing. Chin. J. Heal. Lab. Techn.， 2006， （6）： 661-662

徐小民， 沈向红， 宋国良， 任一平. 中国卫生检验杂志， 2006， （6）： 661-662.

18 YANG XueQin， LU LiXia， XIONG XiaoHui. Food Res. Develop.， 2008， 29（7）： 162-164

杨雪芹， 陆利霞， 熊晓辉. 食品研究与开发， 2008， 29（7）： 162-164

19 GB/T 5009.1912006， Ministry of Health of the People′s Republic of China. Determination of Chloropropanols in Foods， 2006

GB/T 5009.1912006， 中華人民共和国卫生部. 食品中氯丙醇含量的测定， 2006

20 LI Shan， MIAO Hong， CUI Xia， ZHAO YunFeng， WU YongNing. Chin. J. Prev. Med.， 2015， 49（6）： 102-107

李 珊， 苗 虹， 崔 霞， 赵云峰， 吴永宁. 中华预防医学， 2015， 49（6）： 102-107

21 CUI Xia， DING Hao， ZOU JianHong， LI Shan， MIAO Hong， FU WuSheng， ZHAO YunFeng， WU YongNing. Food Sci.， 2014， 35（12）： 98-102

崔 霞， 丁 灏， 邹建宏， 李 珊， 苗 虹， 傅武勝， 赵云峰， 吴永宁. 食品科学， 2014， 35（12）： 98-102

22 GB/T 2762-2012， Ministry of Health of the People′s Republic of China. The Limit of Contaminants in Foods， 2012

GB/T 2762-2012， 中华人民共和国卫生部. 食品中污染物限量， 2012

Abstract A derivatizationfree method for chloropropanols determination in food using online gel permeation chromatographygas chromatographytriple quadrupole mass spectrometry （Online GPCGCMS/MS） with free of derivatization was established. The target compounds were 3monochloropropane1，2diol （3MCPD）， 2monochloropropane1，3diol （2MCPD）， 1，3dichloropropan2ol （1，3DCP） and 2，3dichloropropan1ol （2，3DCP）. Samples were spiked with isotope internal standards， and extracted by matrix solidsupported liquidliquid extraction on the ExtrelutTM NT absorbent. Hexane was added to wash away the apolar matrix interferences and then ethyl acetate was used to extract the target compounds. The concentrated extracts were directly injected into Online GPCGCMS/MS. The good linear relationships for the four types of analytes were obtained in the concentration range of 0.005-1.000 mg/L with correlation coefficients not less than 0.999. The limits of detection and quantitation for chloropropanols in the food samples were in the ranges of 0.002-0.005 mg/kg， and 0.005-0.01 mg/kg respectively. The recoveries and the relative standard deviations （RSD， n=6） for the spiked blank samples at the levels of 0.02， 0.1， 0.5 mg/kg were in the ranges of 94.8%-106.3% （2.2%-10.3%）， 91.8%-108.8% （2.1%-10.6%） and 83.1%-109.4% （1.3%-9.4%）， respectively. The established method was applied to the samples of soy sauce， hydrolyzed vegetables protein solution and powder， cooking wine， chicken powder， bread and cake， and satisfactory results were acquired.

Keywords Food； Chloropropanols； Online gel permeation chromatographygas chromatographytriple quadrupole mass spectrometry； Matrix solidsupported liquidliquid extraction； Derivatizationfree