二维Otsu和改进区域生长法的荧光免疫层析试条浓度的定量检测*

2016-10-21高跃明伊腾增韦孟宇杜民潘少恒

传感技术学报 2016年9期

高跃明，伊腾增，韦孟宇，杜民，潘少恒

（1.福州大学物理与信息工程学院，福州350116；2.福州大学福建省医疗器械和医药技术重点实验室，福州350002；3.澳门大学科技学院电机及电脑工程系，澳门特别行政区999078；4.澳门大学模拟与混合信号超大规模集成电路国家重点实验室，澳门特别行政区999078）

高跃明1，2*，伊腾增1，2，韦孟宇2，3，4，杜民1，2，潘少恒4

目前荧光免疫层析试条的定量检测方法绝大多数采用光电反射法，该方法需要对试条进行高精度的定位并且需要复杂的传动装置。利用CMOS图像传感器获取荧光免疫层析试条的图像信息，采用图像分割方法用于荧光免疫层析试条检测线和质控线进行自动识别，首先对采集到的原始图像进行增强预处理，并进行初步分割。然后选定处理后图像的种子点并通过改进的二维Otsu法选取生长阈值对图像进行区域生长，以实现对图像检测线和质控线的分割。结果表明该方法能够在目标和背景对比度很低的情况下，将图像检测线和质控线的轮廓清晰的分割出来，且区域一致性测度和对比度都比较理想。该方法检测不同浓度的试条，得到的特征值重复性小于5%，线性度大于0.99，准确度大于0.98。实验证明用该方法对荧光免疫层析试条进行定量检测是可行的，且较对比仪器具有更宽的检测范围。

荧光免疫层析试条；图像采集；区域生长；二维Otsu；定量检测

EEACC：7230doi：10.3969/j.issn.1004-1699.2016.09.010

免疫层析法将待测抗原/抗体通过层析的手段与带有标记物的抗体/抗原进行特异性的免疫反应，进而采用光学或电磁学方法检测标记物光强或电信号大小，实现对待测物浓度的间接检测。该方法具有特异性强、结果准确、操作简便、检测快速、可单人份检测等特点，被广泛应用于医学检验、食品安全、毒品抽检等现场快速测试领域［1-2］。

荧光免疫层析试条将荧光颗粒作为显色标记物，通过定量检测荧光信号来实现对待测抗原/抗体的检测。荧光标记物的引入使免疫层析法升级成一种定量检测手段。ESE公司研制的Quant定量侧向层析检测系统（简称Quant），被认为是POCT领域荧光层析检测的标杆［3］。国内推出了一些荧光免疫层析分析系统。如［4］中所提出的基于免疫层析技术的时间分辨荧光免疫分析仪，以及［3］中所提到的荧光免疫层析定量检测仪。但这些仪器大多采用光电扫描的方式来实现。光电扫描法在检测过程中需要对光学传感器和试条进行准确定位。一旦装配过程中存在定位不准，将导致检测结果的偏差。光电扫描法还需要传动装置，传动装置会带来机械振动噪声对检测结果产生影响。本文拟采用图像传感器获取荧光试条的图像，并进行定量检测使得检测噪声减少，并使检测的结果精确度提高。根据荧光免疫层析试条的特点，本文采用一种改进的区域生长法提取试条测试窗口中的检测线和质控线并实现定量检测。首先通过图像增强提高图像目标和背景的对比度，再通过阈值法对图像进行预分割去除部分干扰信息，根据灰度直方图的分布特性及目标区域的连通性作为生长判决条件，用一种改进的二维Otsu法选择生长阈值，并进行区域生长，然后从分割出来的荧光信号图像中获取特征值，最后采用C-反应蛋白CRP（C-Reactive Protein）试条作为检测对象，分析算法的分割精度以及对试条的定量检测精度。

1　定量检测原理

荧光免疫层析检测试条结构如图1所示。待测液通过层析作用向前移动，溶解结合垫上固化的荧光标记物后与之结合。当待测液移动至抗原的检测带时，待测物和试剂的复合物与之发生特异性结合后被截留，结合物在检测线上富集，附着的结合物含量与样品中待测物含量成线性关系。荧光物质在特定波长光的激发下，能产生一定波长的发射光。产生的发射光的强度与试条上富集的反应结合物数量具有相关性［5-6］。

由于荧光试条背景含荧光物质较少，所以被激发出的荧光较微弱。COMS光电图像传感器的光电转换特性是线性的，当单色光入射到COMS光敏单元上时光敏单元的输出信号I与入射光的强度成正比。由于COMS图像传感器采用等间隔均匀量化，所以图像的灰度级正比于COMS对应的光敏单元的输出信号［7］。荧光定量检测主要依据：荧光强度F的值为

其中，φf为荧光α效率，I0为入射光强度，ic为流过平面光发光二极管（LED）的电流强度。α为I0与ic的比例系数，ε为物质溶液的摩尔吸光系数，c为待测溶液浓度，b为液层厚度。这就是荧光定量分析的理论公式。上式表明，在满足待测物为均匀的稀溶液、气体等，溶质分子间相互影响可以忽略不计时，且入射光为单色平行平面光。LED用恒流源供电，其电流强度ic为定值，荧光强度与被测物质的浓度成正比。因此可将检测到的检测线的像素灰度值之和除以质控线像素灰度值之和作为检测结果。

图1　免疫层析检测试条结构图

2　试条信号采集及预处理

本文采用面阵CMOS作为图像采集装置，如图2所示。图像采集装置由波长375 nm的LED光源、CMOS图像传感器和透射波长（615±15）nm的滤光片组成。图像传感器用于采集经过滤光片的图像信号，经过滤光片采集到的图像信号如图3所示。采集到的图片由USB 2.0接口传送到上位机，上位机对图像进行处理得到表示试条浓度的特征值。

由于荧光图像采集时会引入噪声。这些噪声会对荧光信号的提取以及对特征值的提取产生影响［8］，并且图像目标和背景的对比度非常低，为了能成功的将图像分割出来必须对原始图像进行图像增强，本文采用二维高斯低通滤波的方法对图像进行增强。二维高斯低通滤波函数为如式（5）所示。D0为截止频率，D（u，v）是距傅里叶变换平面原点的距离。令式中D0=80。对图像进行增强。图4为增强后的图像。

图2　荧光免疫层析试条图像采集装置

图3　荧光免疫层析试条图像信号

图4　经过增强后的试条图像

由于荧光试条检测线和质控线的亮度比背景要高且检测线和质控线占整幅图像的面积不超过10%，假设在一幅荧光检测图像中图像背景的灰度值不超过T，整幅图像的像素数为n，灰度值不超过T的像素数为m，当m/n＜10%，且（m+1）/n＞10%时的T值作为分割阈值，进行预分割。

3　基于改进的区域生长算法

一般来说图像分割就是将图像按照颜色、强度、纹理等划分为若干个特定的互不重叠的区域，并且从这些区域中提取感兴趣的目标区域的技术和过程［9］。区域生长方法需要先选取生长种子点，在满足一定的同质标准前提下，逐渐聚集种子点周围的像点，形成一个渐渐增大的同质区域，直到所有满足同质标准的点都被加到该区域中结束。该方法可以看作是一个连续的聚集过程，运行结果取决于图像像素点的处理顺序，优点是所得到的同质区域在空间上不仅相互关联而且紧凑，缺点是可能造成过分割［10］。

本文选取检测线和质控线的中间线作为边界线，将试条图像分为检测线区域和质控线区域分别进行处理。首先必须选择合适的种子点，由于试条的荧光信号波长是615 nm，镜头前的滤光片透射波长（615± 15）nm，所以在荧光物质富集的检测带和质控带上，荧光信号亮度要普遍大于背景区域的亮度。针对该特征，我们采用3×3的矩阵去遍历整个图片，将矩阵内像素点的平均灰度值最大的区域的中间灰度作为区域生长的生长起点。然后，选用相邻点阈值差法作为生长准则。设图像中某一符合生长要求的点，记灰度值为f（x，y），当该点8连通区域的相邻点f（x1，y1）的像素值与生长点之差小于某个阈值（threshold）时，则认为该点符合生长准则，判断该点为新的生长起点。

式中，seed为种子点，t为选取的生长阈值。

由于增强后图像的灰度直方图的波峰和波谷不那么明显。本文引入二维灰度直方图的Otsu法。该方法不仅充分利用了图像像素点的信息，而且考虑到了像素点与其邻域的空间有相关信息，具有较好的抗噪性。本文采用论文［11］提出的改进二维Otsu法求取阈值t和s，其中t为原图像的阈值，s为平滑后图像的阈值。

对原图像进行3×3领域平均平滑得到一平滑图像，这一平滑图像与原图像构造出一个二维直方图。二维直方图上任意一点的值是pij，下标i和j表示二维直方图的横纵坐标，横坐标为原图像灰度统计值纵坐标为平滑后图像的灰度统计值，该值表示图像在原图像灰度为i平滑图像上灰度为j的概率。假设图像被阈值对（s，t）分成C0和C1，其中C0为目标图像C1为背景图像，它们的概率分别是w0和wb，L为灰度值上限，计算公式如式（7）所示。

类内均值矢量m0和mb。分别为

二维Otsu法的类间方差的迹为

最佳阈值为

将求出的阈值分别作为平滑图像和原始图像的区域生长的阈值对图像进行分割。分割结果如图5所示。

图5　图像分割结果

4　实验结果与分析

本文选用WP-UF500M相机采集图像。光谱响应范围350 nm～1 100 nm，曝光时间在0.038 ms～3 000 ms范围可调，信噪比为38.1 dB，动态范围70.1 dB。实验采用TH-UV365T3WA-3535-B发光二极管作为激发光源。该发光二极管经过凸透镜的聚焦后，在一定的圆形范围内产生均匀的平面光。检测设备实物图如图6所示。

图6　检测装置实物图

本文选取区域一致性测度UM和区域对比度CR［12］作为评价准则，其定义见式（13）～式（15）。

式中A为归一化因子，这里指整幅图像的像素数。

式中，f（x，y）为像素（x，y）的灰度值，mi为对应分割区Ri内的像素数，为方差，下标i等于1表示目标图像方差为2表示背景图像方差。

式中f0、fb分别为目标区域和背景区域的平均灰度级。CR取值范围在0～1之间，CR越大目标与背景的对比度越大分割效果越好。不同浓度的荧光试条分割后的评价结果如表1所示。

表1　分割性能评价

表1显示本文的分割算法比较理想，此外可以看出随着试条荧光物质含量的升高，其检测线和背景的灰度对比度会变得比较高，所以CR值也会变得比较高。

要实现定量检测必须先求取特征值，本文将分割后检测线的灰度值全部相加得到检测线特征值t，将分割后质控线的灰度值全部相加得到质控线特征值c，将检测线的特征值和控制线的特征值的比值t/c作为特征值。特征值与免疫层析标准试条的浓度成正比，反应了试条的浓度。由特征值t/c所表示的检测结果见表2。

表2　6种浓度试条的特征值及重复性

实验中检测6种浓度的CRP试条，并选择变异系数来判断检测结果效果的重复性。变异系数CV（variable coefficient）的定义如式（16）

其中，SD为所测样本特征值的标准差，MN为所测样本特征值的平均值。

从表2可以看出本文方法得到的CV值不超过5%，检测结果的重复性较好。

选用ESE公司的Quant检测仪作为参照来验证本文的检测精度。Quant对不同浓度的试条检测得到的特征值如表3所示。

表3　Quant检测不同浓度的试条得出的特征值

Quant检测仪虽然检测精确度高，但是量程有限，对表2中810 ng/mL和2 430 ng/mL两种浓度试条检测结果为超量程。本文选用浓度为10 ng/mL、30 ng/mL、90 ng/mL、270 ng/mL的4种试条验证仪器的检验精度。图7表示本文检测结果与Quant检测结果的相关性，R2＞0.98，具有很高的相关性。

图7　本实验特征值和Quant特征值的线性关系

进一步，挑选6种浓度试条的测量值均值进行刻度曲线拟合，拟合结果如图8所示。

图8　荧光信号特征值与浓度间的拟合曲线

线性关系为

式中，y为特征值t/c，x为待测液浓度，线性度R2＞0.99。实验结果表明本文算法得到的特征值有较好的线性度。

5　结论

本文阐述了荧光免疫层析试条的定量检测原理，设计了基于图像采集法的荧光免疫层析试条定量检测装置，针对图像检测结果，提出了基于二维Otsu和区域增长算法的图像分割和定量检测方法。实验结果显示，本文研制系统检测结果的变异系数CV不大于5%；刻度曲线的线性度为0.997 8；与Quant检测仪的检测结果相关性大于0.98，说明检测精度良好。

同时，本文检测装置的测量范围较Quant检测仪更宽，具有更好的适用性。此外，由于本文采用的图像检测方法无需的试条传动装置，以及精确的试条定位装置，简化了仪器的加工流程和装配工艺，且易于扩展到多通道试条检测。

（注：由于通过图像分割方法检测荧光试条的研究较少，仅论文［8］采用图像分割方法进行定量检测。但该论文未对变异系数CV值做分析。本文所提出方法的变异系数、刻度曲线线性度，以及所测得的特征值与Quant检测仪所测得的特征值的相关性均可与Quant检测仪相比，且检测范围优于Quant。这些指标的获得都是建立在前期良好的分割精度基础之上。）

［1］Lin R，Skandarajah A，Gerver R，et al.A Lateral Electrophoretic Flow Diagnostic Assay［J］.Lab on a Chip，2015，15（1）：1488-1496.

［2］Su J，Zhou Z，Li H，et al.Quantitative Detection of Human Chori⁃onic Gonadotropin Antigen Via Immunogold-Chromatographic Test Strips［J］.Analytical Methods，2014，2（6）：450-455.

［3］刘翔，杜民，李玉榕，等.荧光免疫层析定量检测系统的设计与实现［J］.电子测量与仪器报，2013，27（9）：859-866.

［4］任冰强，黄立华，黄惠杰.基于免疫层析技术的时间分辨荧光免疫分析仪研究［J］.仪器仪表学报，2009，30（6）：1330-1335.

［5］高跃明，李天麒，林传阳，等.荧光免疫层析试条光电信号处理及特征量选取［J］.电子测量与仪器学报，2015，29（5）：662-668.

［6］刘婷婷，屈渲婷.荧光免疫层析试条定量检测仪的研制［J］.现代电子技术，2013，36（15）：95-98.

［7］王有庆.图像传感器应用技术［M］.北京：电子工业出版社，2003：78-99.

［8］胡贝贝，张雪青，陈昊鹏，等.基于金字塔连接与高斯混合模型算法的层析芯片荧光信号检测［J］.中国医疗器械杂志，2011，35（2）：83-86.

［9］张馨，赵源萌，张存林.被动式太赫兹图像分割算法［J］.强激光与粒子束，2013，25（6）：1597-1600.

［10］姜慧研，司岳鹏，雒兴刚.基于改进的大津方法与区域生长的医学图像分割［J］.东北大学学报（自然科学版），2006，27（4）：398-401.

［11］陈琪，熊博莅，陆军.改进的二维Otsu图像分割方法及其快速实现［J］.电子与信息学报2010，32（5）：1100-1104.

［12］郑欣，彭真明.基于活跃度的脉冲耦合神经网络图像分割［J］.光学精密工程2013，21（3）：821-827.

高跃明（1982-），2010年于福州大学获得博士学位，现为福州大学副研究员，主要研究方向为生物电子学等，fzugym@ 163.com；

伊腾增（1986-），男，福建福州人，现为福州大学硕士研究生，主要从事数字图像处理方面的研究，1537582009@qq.com。

Fluorescent Immune-Chromatographic Strip Quantitative Detection Based on Two-Dimensional Otsu Method and Region Growth Algorithm*

GAO Yueming1，2*，YI Tengzeng1，2，WAI Mangi2，3，4，DU Min1，2，PUN Siohang4
（1.College of Physics and Information Engineering，Fuzhou University，Fuzhou 350116，China；2.Key Lab of Medical Instrumentation&Pharmaceutical Technology of Fujian Province，Fuzhou University，Fuzhou 350002，China；3.State Key Laboratory of Analog and Mixed Signal VLSI，University of Macau，Macau SAR，999078，China；4.Department of Electrical and Computer Engineering，Faculty of S&T，University of Macau，Macau SAR，999078，China）

Existing immunofluorescence chromatographic quantitative detection technology methods are mostly based on photoelectric reflex method.High precision for the strip position，and complex strip transmission unit are required in this method.In this paper，image of fluorescent immune-chromatographic strip was captured by the CMOS image sensor.A method for automatic recognition of test line and control line was proposed，In this method，seed points was chosen after the image was enhanced and initial segmented.Then the growth threshold was set via the improved two-dimensional Otsu method.Finally，the region growth algorithm was implemented to segment test line and control line.Experimental results showed that the algorithm could precisely segment the test line and con⁃trol line，and finally realized the quantitative detection of fluorescent immune-chromatographic strip.The experi⁃ments proved that the segmented test line and control line is clear，complete and had excellent performance，even in conditions of a low contrast or a changeable background.The proposed method indexes on quantitative evaluation of the segmentation result，such as Uniformity Measure（UM），Regional Contrast（CR），were both well.In the quantita⁃tively detect step，the coefficient variation of the measured characteristic values was less than 5%and the linearity was mare than 0.99.The experimental results shown that the method was feasible for the quantitative detection of fluorescent immune-chromatographic strip，and had wider detection limit than the comparing instrument.

fluorescent immune-chromatographic strip；image capture；region growth；two-dimensional Otsu；quan⁃titative detection