湿地松侧芽增殖快繁技术研究

程方 叶建仁

摘要 初步探索了以湿地松幼树新生芽为外植体的侧芽增殖植株再生体系的条件，结果表明，4月中下旬为湿地松侧芽增殖最佳采样时间；20 mg/L抗坏血酸（VC）对湿地松新抽芽的褐化有一定抑制作用；6-BA的浓度为7 mg/L时，湿地松外植体的萌动最明显；改良GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1 mg/L GA3对经高浓度6-BA处理后萌动的外植体的侧芽增殖起促进作用；0、1、3、5 mg/L的GA3培养基均对新采集的外植体侧芽的诱导没有促进作用；改良GD+6 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA、改良GD+8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA成功诱导出侧芽或不定芽，侧芽在后期培养中生长良好。

关键词 湿地松；侧芽增殖；外植体；快繁技术；新抽芽

中图分类号 S791.246 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）09-0160-02

Abstract Study on lateral buds proliferation of Pinus elliottii was done. The main results were as followed：the best acquisition time of explants was in mid-April；20 mg/L of VC could inhibite the explants to brown；the explants germinated obviously on the media with 7 mg/L 6-BA；the explants on modified GD media with 4 mg/L 6-BA and 0.2 mg/L NAA and 1 mg/L GA3 induced lateral bud on high concentration 6-BA；0，1，3，5 mg/L of GA3 medium had no promating effect for the new collection of explant of lateral bud；the explants on modified GD media with 6 mg/L 6-BA and 0.4 mg/L NAA，modified GD media with 8 mg/L 6-BA and 0.3 mg/L NAA induced lateral bud successfully，and the buds grew well in the latter time.

Key words Pinus elliottii；lateral buds proliferation；explants；propagation technology；new buds

植物微体繁殖的植株再生途径有体细胞胚胎发生植株再生、器官发生植株再生、侧芽增殖植株再生[1]。在抗病育种过程中，利用种子萌发获得带子叶顶芽作为起始外植体的器官发生方式获得的再生植株，其抗病性是否能保持和母本一致，还需在后期进行抗病性测定。而侧芽增殖是利用顶芽和侧芽中已经形成的芽分生组织来进行增殖的，比器官发生再生植株在遗传性上更稳定、自发性变异频率低、再生完整植株所需的培养时间短等优点。目前以湿地松成熟胚、离体胚无菌苗、无菌实生苗等为外植体，成功地建立其器官发生的组织培养再生体系，并且获得的试管苗移栽成活[2-3]，暂无湿地松侧芽增殖的相关报道。因此，探索湿地松侧芽增殖再生体系的条件，对加快湿地松抗病育种进程显得尤为重要。

1 材料与方法

1.1 试验材料及无菌处理

2009年3—5月不同时间段的晴天中午分别采集南京林业大学后山苗圃五年生湿地松新抽芽为外植体，将其用洗洁精水浸泡0.5 h，流水冲洗2 h，于超净工作台上用75%酒精浸泡30 s后用0.1%升汞中灭菌3.5 min，转接至设计的初诱导培养基中。

1.2 初诱导培养基的设计

改良GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培养基培养不同时间采集的外植体，观察芽的成活、污染情况，筛选出最佳采样时间；改良GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培养基，设置抗坏血酸浓度为0、10、20、40 mg/L，观察统计外植体的褐化情况；以改良GD为基本培养基，NAA浓度0.2 mg/L，设置6-BA浓度为4、5、6、7 mg/L；改良GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的培养基，设置赤霉素（GA3）浓度为0、1、3、5 mg/L。以改良GD为基本培养基，A因素（6-BA浓度为4、6、8 mg/L）、B因素（NAA浓度为0.2、0.3、0.4 mg/L）进行完全随机试验，观察统计诱导情况。

2 结果与分析

2.1 不同采集时间对湿地松新抽芽污染与成活的影响

外植体的分化程度及幼嫩程度對诱导结果有很大影响。因此，外植体的采集时间也成为影响试验结果的关键因素之一。从春季不同采集日期，分析最佳外植体采集时间，为以后湿地松进行大规模组织培养工作提供依据。结果显示，4月12日采集的外植体成活率最高，为83.3%，4月29日采集的外植体成活率次之，为81.2%，而4月22日的成活率也达到了75%的较高值。可见，在4月中下旬采集的外植体成活率比3月、5月的高得多，为较佳采集时间（表1）。处在迅速生长期的新抽芽及新梢茎段在不同的采集时间随着新抽梢的伸展，其鳞片状的芽被渐少，在相同的灭菌时间里污染率也会随着采集时间的推迟而变化。

2.2 抗坏血酸（VC）使用浓度对湿地松新抽芽褐变的影响

抗坏血酸（VC）有防止材料褐变、抵制多酚类物质的作用。本次结果表明，添加抗坏血酸对外植体的褐化有一定的抑制作用，添加浓度为20 mg/L时，其褐化率最低，为25%，同时成活率最高，为50%（表2）。

2.3 6-BA对湿地松新抽芽诱导的影响

6-BA的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。40 d后观察到所有成活的外植体底部均膨大形成愈伤组织，6-BA浓度为7 mg/L的培养基中外植体的萌动最明显（图1D），其他浓度中的外植体只有稍微的萌动。

2.4 赤霉素（GA3）的添加对湿地松新抽芽启动诱导的影响

孙锡本等[4]研究表明，赤霉素对苹果侧芽萌发有明显的促进作用。本试验结果表明，经赤霉素处理30 d后外植体均没有增殖出侧芽，表明在GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/LNAA培养基中，赤霉素浓度为0、1、3、5 mg/L均对湿地松侧芽的诱导没有促进作用（图2）。

2.5 赤霉素（GA3）对经6-BA处理过的湿地松新抽芽启动诱导的影响

试验结果显示，经不同浓度6-BA处理过的外植体转接到GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+GA3（0、1 mg/L）的培养基中，30 d后观察到萌动的外植体转入不含赤霉素的培养基中只长出顶芽和针叶，没有侧芽（图3B），没有萌动的外植体转入不含赤霉素的培养基后略微露出顶芽（图3A）；萌动的外植体在含赤霉素的培养基中成功诱导出侧芽（图3D），而没有萌动的外植体即使转入含赤霉素的培养基中，也不能诱导出侧芽（图3C）。表明经高浓度6-BA处理后，赤霉素对萌动的外植体的侧芽增殖起促进作用。

2.6 6-BA、NAA组合对湿地松新抽芽初代诱导的影响

试验结果显示，GD+6 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA（图4F）和GD+8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA（图4H）成功诱导出侧芽或不定芽，增殖出的侧芽在后期培养中生长良好（图5），其余处理的外植体在培养过程中有的褐化死亡；有的长出小芽点（图4B、4E），后期死亡。

3 结论与讨论

试验结果表明，在4月中下旬采集的外植体比其他时间段采集的成活率高很多，为最佳采集时间。褐变是由于外植体中的多酚氧化酶被激活，使细胞的代谢发生变化，酚类物质被氧化后产生呈棕褐色的醌類物质，它们会逐渐扩散到培养基中，抑制其他酶的活性，毒害培养的材料[5]。褐变的影响因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，危害程度也有区别[6]。许多研究表明，选择适当的外植体和培养条件是克服褐变的最主要手（下转第165页）

段。VC作为抗氧化剂有一定的抗褐变功能，本试验结果表明添加20 mg/L的VC对湿地松新抽芽的褐化有一定抑制作用。VC一般使用浓度为5 mg/L，本试验高出3倍，可能是由于材料类型、年龄等不同对VC的敏感度不同的原因。由于6-BA具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点，因而被广泛采用，并且是组织培养中最常用的细胞分裂素。6-BA的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。

张庆瑞等[7]研究表明，GA3具有打破芽休眠的生理作用，是影响芍药茎尖启动培养的主要因素，在一定的浓度范围内随着GA3浓度的提高，启动率也相应增加。GA3与6-BA混合使用时芍药芽萌动快，且利于芽的高生长。张晓英等[8]研究表明，BA和IBA与GA3 配合使用有利于树莓芽的诱导和生长。本试验结果表明，6-BA的浓度为7 mg/L时，外植体的萌动最明显，其他浓度有稍微的萌动；GD+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+1 mg/L GA3对经高浓度6-BA处理后萌动的外植体的侧芽增殖起促进作用。GD+4 mg/L 6-BA+NAA 0.2 mg/L+0、1、3、5 mg/L GA3的培养基均对新采集的外植体侧芽的诱导没有促进作用。6-BA、NAA组合试验表明，GD+6 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA、GD+8 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA成功诱导出侧芽或不定芽，增殖出的侧芽在后期培养中生长良好。由于试验材料有限，本试验未获得大量侧芽，同时也说明了湿地松侧芽增殖的条件是复杂的，要建立高效稳定的侧芽增殖体系，还需要做进一步的研究。

4 参考文献

[1] 唐巍，伍美保，杨映根.植物的微体繁殖[J].植物杂志，1996，12（5）：34-35.

[2] 何月秋.湿地松抗病家系组培繁殖技术研究[D].南京：南京林业大学，2003.

[3] 朱丽华，张艺，吴小芹.湿地松的组织培养及植株再生[J].南京林业大学学报（自然科学版），2004，28（6）：47-51.

[4] 孙锡本，夏国京，曲芳.利用6-BA、GA3促进苹果侧芽萌发试验研究[J].熊岳农专学报，1997，13（2）：6-9.

[5] 潘瑞炽.植物组织培养[M].广州：广东高教出版社，2000.

[6] 缪耀梅，李开彪，叶添谋.组织培养过程中污染和褐化的防治[J].韶关学院学报（自然科学版），2003，24（6）：102-103.

[7] 张庆瑞，杨秋生，李永华.不同植物生长调节物质对芍药离体培养的影响[J].河南农业大学学报，2007，41（1）：25-28.

[8] 张晓英，董丽芬，吴成亮.赤霉素和外植体生长状态对树莓芽增殖的影响[J].西北林学院学报，2004，19（3）：34-35.