淋巴瘤磁共振表观弥散系数与肿瘤细胞密度及淋巴瘤进展的相关性

廖成成唐 琪吴圣明覃云英

1.广西医科大学附属肿瘤医院淋巴血液肿瘤科，广西南宁530021；2.广西医科大学附属肿瘤医院影像科，广西南宁530021；3.广西医科大学附属肿瘤医院病理科，广西南宁530021

淋巴瘤磁共振表观弥散系数与肿瘤细胞密度及淋巴瘤进展的相关性

廖成成1唐 琪2吴圣明3覃云英2

1.广西医科大学附属肿瘤医院淋巴血液肿瘤科，广西南宁530021；2.广西医科大学附属肿瘤医院影像科，广西南宁530021；3.广西医科大学附属肿瘤医院病理科，广西南宁530021

目的探讨磁共振弥散加权成像（DWI）的淋巴瘤表观弥散系数（ADC）值与肿瘤细胞密度及淋巴瘤进展的相关性。方法制备20只Raji淋巴瘤Balb/c荷瘤裸鼠，对其不同生长阶段的淋巴瘤进行MR扫描，运用Image J软件进行病理学分析及肿瘤细胞密度测量。统计分析ADC值和肿瘤细胞密度的相关性及与肿瘤细胞不同生长阶段之间的关系。结果肿瘤接种后第5周淋巴瘤ADC值［（0.58±0.07）×10-3mm2/s］显著低于接种后第3周［（0.74±0.08）×10-3mm2/s］，差异有高度统计学意义（t=4.722，P<0.01）；肿瘤接种后第3周的肿瘤细胞密度［（45.84± 3.57）%］显著低于接种后第5周［（55.51±2.98）%］，差异有高度统计学意义（t=6.561，P<0.01）；淋巴瘤ADC值与淋巴瘤细胞密度及淋巴瘤进展均呈显著负相关（r=-0.97、-0.97，均P<0.01）。结论淋巴瘤ADC值可用于分析和评价淋巴瘤的进展，进而判断预后，指导治疗，监测疗效。

淋巴瘤；肿瘤细胞密度；淋巴瘤进展；表观弥散系数值

［Abstract］Objective To study the correlation of apparent diffusion coefficient（ADC）value with the tumor cellularity density and the development of lymphoma.Methods Twenty Raji cell stress nude mice were prepared.MR was used to scan their different grow stage.Pathological analysis and the cellularity density were detected by Image J software.The correlation of ADC value with tumor cell density and the different progress were statistically analyzed.Results The ADC value of the 5th week after inoculation［（0.58±0.07）×10-3mm2/s］was significantly lower than the value of the 3th week after inoculation［（0.74±0.08）×10-3mm2/s］，the difference was statistically significant（t=4.722，P<0.01）；the density of xenograft at the 3th week after inoculation［（45.84±3.57）%］was significantly lower than that of the 5th after inoculation［（55.51±2.98）%］，the difference was statistically significant（t=-6.561，P<0.01）；ADC value was negatively correlated with cellularity density and the stage of lymphoma progression（r=-0.97，-0.97，all P<0.01）.Conclusion ADC value can be used to analyze and evaluate the density and development process of lymphoma，and judgment the prognosis，thus direct the treatment，monitoring efficacy.

［Key words］Lymphoma；Tumor cell density；Lymphoma development process；Apparent diffusion coefficient

侵袭性淋巴瘤是化疗可以治愈的恶性肿瘤之一，因而化疗后疗效评估的准确性对于临床医生采用适宜的化疗方案和及时准确的改变治疗策略显得尤为重要。B超、增强CT为两种运用广泛的影像学评估手段，但较难鉴别化疗后淋巴瘤细胞残留与化疗后组织坏死、纤维化，已经无法适应现阶段淋巴瘤的个体化及精准治疗。近年来，PET/CT因能够将代谢活跃的残留病灶显像，成为侵袭性淋巴瘤疗效评价的推荐手段［1］。但PET/CT检查费用高、造影剂具有电离辐射、对于惰性的淋巴瘤诊断的敏感性及特异性低、组织分辨率较差等局限性，限制了其在临床的推广；特别是在年轻的人群中，电离辐射的暴露有着比年长者更高的电离辐射诱导的第二肿瘤的发生率［2-3］。磁共振作为一种非电离辐射的手段广泛应用于各实体肿瘤的诊断及疗效评估中。磁共振弥散加权成像可通过表观弥散系数值（apparent diffusion coefficient，ADC）值反映水分子在活体组织内的弥散运动，可达到了类PET的功能成像效果，从而间接评估肿瘤细胞增殖速度及密度，本研究主要探讨淋巴瘤磁共振弥散加权成像（diffusion weighted imaging，DWI）ADC与肿瘤细胞密度及淋巴瘤进展的相关性。

1　对象与方法

1.1对象

选取20只SPF雄性Balb/c裸鼠［广西医科大学实验中心，许可证号：SYXK-（桂）2014-0002，实验动物合格证编号：No.45000300000546］。周龄4～5周，平均（5.0±1.0）周；平均体重（16.5±0.5）g。在广西医科大学实验动物房饲养，将环境温度调节在22～25℃，相对湿度调节在50%～60%。实验细胞为人Burkitt's淋巴瘤细胞株Raji细胞，由广西医科大学医学科学实验中心提供。本实验经广西医科大学动物伦理委员会审批通过，并按照动物伦理委员会的要求实施实验。

1.2仪器与试剂

磁共振动物专用线圈直径5 cm（江阴万康医疗科技有限公司）；GE discovery 750W 3.0T磁共振扫描仪（日本GE healthcare公司）；RPMI-1640培养基（上海博升生物科技有限公司）；胎牛血清（上海恪敏生物科技有限公司）。

1.3方法

1.3.1细胞培养和处理及淋巴瘤动物模型制备采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、5% CO2培养箱中培养Raji淋巴瘤细胞。取对数期生长的Raji细胞，调整细胞浓度为5×107/mL，将0.2 mL细胞悬液接种在每只Balb/c鼠右下肢皮下。每天对小鼠进行检查，观察小鼠肿瘤的生长情况。严格依据淋巴瘤细胞接种后时间将其分为接种后第3、5周两个阶段。

1.3.2磁共振检查和图像处理分别于开始移植瘤接种后第3周及第5周对小鼠进行磁共振扫描，扫描前用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉小鼠。麻醉满意后在磁共振动物专用线圈内放置荷瘤小鼠，取仰卧位并固定于线圈中央。首先行TSE T2WI轴位、矢状位扫描定位肿瘤，后行DWI轴位扫描，扫描参数：TSE T2WI：TR/TE 4000 ms/85 ms，翻转角150°，FOV 56 mm×90 mm，矩阵200×320，层厚/层距7 mm/1 mm，回波链长度（echo train length）：10；DWI采用单次激发SE-EPI序列TR/TE 3000 ms/58.5 ms、翻转角150°，FOV 76 mm×80 mm，矩阵128×125，层厚/层距7 mm/1 mm， b值分别为0、800 s/mm2，在X、Y、Z轴方向施加弥散敏感梯度。磁共振扫描仪所获取的DWI数据采用GE Medical Systems Functool 9.4.05软件重建ADC图。在病灶最大层面避开囊变、坏死、出血区及邻近区域，选择信号较均匀区域为感兴趣区（ROI），获取病灶的ADC值。每1个病灶层面进行3次测量后取平均值。

1.3.3细胞密度分析测量ADC后取得BALB/c裸鼠移植瘤病理组织标本，将标本用福尔马林固定后送病理科，包埋、切片、常规HE染色。每张组织切片（HE染色，200倍）随机选取5个视野，选取视野尽量避开，坏死、炎症及血管等区域，图片经电子显微照相机（奥林巴斯DP22）拍摄保存后导入计算机。所有照片用ImageJ 2.1.4软件分析处理，将彩色病理照片转换为8位灰阶黑白图片，再选择合适阈值，计算机自动统计出每个视野中细胞核面积占照片面积百分比即为肿瘤细胞密度，用百分率表示，每个淋巴瘤标本的细胞密度为5个视野的平均值。

1.4统计学方法

采用语言软件包（R version 3.3.1，www.r-project.org）统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；分别采用Pearson相关分析、Spearman等级相关分析淋巴瘤ADC值与细胞密度、淋巴瘤进展计数的相关性；以P< 0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1荷瘤小鼠病理切片及磁共振图像的表现

肿瘤接种后第3周的荷瘤小鼠病理切片可见，瘤细胞较稀疏，间质成分较多；肿瘤接种后第5周的荷瘤小鼠病理切片可见，细胞较致密，间质成分较少。肿瘤接种后第5周的小鼠瘤细胞排列较接种后第3周的致密，间质成分也较少，见图1。小鼠磁共振瘤体DWI图像呈高信号，而ADC图像信号减低。肿瘤接种后第5周的小鼠瘤体DWI信号较接种后第3周的增强，而ADC信号较接种后第3周的减弱，见图2。

2.2不同发展阶段淋巴瘤ADC值和淋巴瘤细胞密度的差异

肿瘤接种后第3周淋巴瘤ADC值显著高于接种后5周的淋巴瘤（t=4.722，P<0.01），肿瘤接种后3周的淋巴瘤细胞密度显著低于接种后第5周的淋巴瘤（t=6.561，P<0.01）。见表1。

2.3淋巴瘤细胞密度、淋巴瘤进展与ADC值的相关性分析

淋巴瘤ADC值与淋巴瘤细胞密度及淋巴瘤进展均呈显著负相关（r=-0.97、-0.97，均P<0.01）。见图3。

表1　不同发展阶段淋巴瘤ADC值和肿瘤细胞密度（）

表1　不同发展阶段淋巴瘤ADC值和肿瘤细胞密度（）

注：ADC：表观弥散系数

肿瘤接种时间只数ADC值（×10-3mm2/s）肿瘤细胞密度（%）接种第3周接种第5周10 10 t值P值0.74±0.08 0.58±0.07*4.722 <0.01 45.84±3.57 55.51±2.98*6.561 <0.01

图1　荷瘤小鼠的病理图像（HE，200×）

图2　荷瘤小鼠的磁共振图像

图3　淋巴瘤细胞密度与磁共振ADC值相关性

3　讨论

磁共振成像技术因可直接显示任意角度的切面像、无电离辐射、拥有高于CT数倍的软组织分辨能力及不用造影剂就可得到很好的软组织对比度等优势，在恶性肿瘤的诊断及疗效评估方面日益得到广泛的应用，但传统的磁共振成像及其扫描序列难以提供肿瘤病理学及增殖程度的信息，而DWI为磁共振的一种功能成像技术，不仅能够反映肿瘤形态学的变化，还能够直接反映活体内水分子的微观运动。与传统的结构性磁共振成像技术比较，它能提供如细胞膜完整性、组织结构等更多的分子生物学信息，从而间接反映肿瘤细胞的增殖活性［4-5］。

DWI技术通过对组织施加弥散敏感的梯度脉冲后测定组织中水扩散受限的方向及程度来间接反映组织的微观结构变化。DWI信号衰减参数称为ADC，ADC值可以反映肿瘤细胞密度并能够对水分子在活体组织内的弥散运动状况进行定量评价［6］，理论上能更早地预测肿瘤进展及判断治疗效果。相关医学研究表明［7］，DWI一方面对水分子在细胞内外间隙的弥散运动变化敏感，另一方面还对细胞水肿敏感，钠钾泵功能障碍可能是诱发因素之一，ADC值可有效地在组织微观水平上反映出这些变化，ADC值将可能成为一种分析细胞功能的有效参数。

一般来说，恶性增殖的肿瘤细胞密度要远高于良性肿瘤，大量的细胞实验［8-10］及动物实验［11-13］证实，恶性肿瘤分化程度越差、细胞增殖越活跃，其肿瘤组织内水分子扩散受限效应越显著。Lyng等［8］研究发现，细胞密度高的同一种类的肿瘤细胞，有更低通透性的半透明细胞膜、相对更高的细胞内水含量、相对更小的细胞外间隙与细胞密度可使其内自由水分子的弥散受限，与其磁共振的ADC值呈正相关。此外，肿瘤细胞的异形性、病理类型、细胞核浆比例、肿瘤间质成分、血流灌注情况等亦是导致ADC值改变的因素［14-15］。

尽管已有较多的研究证实多数各类恶性肿瘤的细胞密度与其ADC值呈负相关，但淋巴瘤的细胞密度、进展与ADC值的关系研究较少［16］，本研究结果显示，在淋巴瘤小鼠模型中，淋巴瘤细胞的密度及肿瘤进展均与淋巴瘤的ADC值呈显著负相关，与既往多数研究相符［17］。其机制可能为淋巴瘤细胞密度随着肿瘤的生长增殖而增加，细胞外的空间将受到压缩，细胞外间质水的流动性减少，进而引起细胞内的水分子扩散受限。细胞内外两种因素综合作用使得水分子的扩散运动受到极大程度的限制，其相应区域的肿瘤的ADC值也随之降低［18-20］。相反如果在肿瘤坏死区域，由于细胞间成分增多，水分子扩散障碍减少，其ADC值升高［21］。

综上所述，本研究发现，淋巴瘤ADC与肿瘤细胞密度及淋巴瘤进展呈显著负相关。这可能可以帮助临床医生对淋巴瘤进展进行分析和评价，进而对预后进行判断，对治疗进行指导，对疗效进行监测，亦可为DWI技术在淋巴瘤诊断相关的临床试验提供参考依据，值得临床充分重视。但ADC值大小变化与近期疗效的相关性以及是否能对淋巴瘤远期疗效进行预测等诸多问题还需更多的研究进一步探讨。

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Correlation of MRI apparent diffusion coefficient with tumor cell density and development process of lymphoma

LIAO Chengcheng1TANG Qin2WU Shengming3QIN Yunying2
1.Department of Oncology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning530021，China；2.Department of Imaging，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning530021，China；3.Department of Pathology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning530021，China

R733

A

1673-7210（2016）09（c）-0031-04

2016-04-20本文编辑：任念）

广西壮族自治区卫生和计划生育委员会自筹经费科研课题项目（Z2016504）。