温度、冻存液体积和操作时间对小鼠卵子Cryotop玻璃化冻融复苏率的影响

饶金鹏　邱　枫　刘　青　蔡益婷　金　敏　金　帆

1.浙江大学医学院附属第二医院生殖医学中心，浙江杭州310052；2.浙江大学医学院附属妇产科医院生殖医学中心，浙江杭州310006

温度、冻存液体积和操作时间对小鼠卵子Cryotop玻璃化冻融复苏率的影响

饶金鹏1邱枫1刘青1蔡益婷1金敏1金帆2

1.浙江大学医学院附属第二医院生殖医学中心，浙江杭州310052；2.浙江大学医学院附属妇产科医院生殖医学中心，浙江杭州310006

目的探讨Cryotop法中冷冻操作环境温度、加载覆盖的保护液微滴体积以及投入液氮前暴露于高浓度冷冻保护剂（CPA）的时间对小鼠MⅡ期卵子玻璃化冻融效果的影响。方法对6周龄KM系小鼠促排卵、脱颗粒细胞以获得形态良好的MⅡ期卵子，用Cryotop法对其进行玻璃化冻融，卵母细胞随机分组后实验方案如下：根据冷冻环境温度的不同，设置37℃操作组和22℃操作组；根据薄膜上包被的保护液微滴体积的不同，设置<0.1 μL组、0.1～0.5 μL组和>0.5～1.0 μL组；根据与CPA的接触时间的不同，将冷冻卵子分为30～40 s暴露组、>40～90 s暴露组和>90～180 s暴露组。随后对各组卵母细胞的复苏率进行统计比较。结果22℃操作组小鼠卵子的复苏率为81.4%，显著高于37℃操作组的50.7%，差异有高度统计学意义（P<0.01）。选择22℃的操作环境，<0.1 μL组、0.1～0.5 μL组、>0.5～1.0 μL组复苏率（85.7%、90.5%、83.2%）比较，差异无统计学意义（P>0.05）。>90～180 s CPA暴露组的卵子复苏率为74.7%，低于30～40 s暴露组（83.3%）和>40～90 s暴露组（78.9%），差异无统计学意义（P> 0.05）。结论使用Cryotop法冻融卵母细胞时，不必刻意追求<0.1 μL的保护液加载体积。卵子在高浓度CPA中的暴露时间不宜过长，且控制在30～90 s内对其存活率无明显影响。在常温（22℃）环境下进行操作可改善复苏结局。

玻璃化冷冻；小鼠；卵母细胞；温度；体积；处理时间；复苏率

［Abstract］Objective To evaluate the effects of the temperature，volume and treatment duration of loading CPA solution on the survival rate of oocytes vitrification.Methods Oocytes were obtained from the female KM mice aged six weeks after superovulation.Matured oocytes at MⅡstage were frozen with Cryotop vitrification method at the environmental temperature of 37℃or 22℃，microdrop volume of<0.1，0.1-0.5，>0.5-1.0 μL，and time of oocyte treated in CPA solution of 30-40，>40-90，>90-180 s.The survival rates of warmed oocytes in the different treatments were compared. Results The oocyte survival rate at 22℃of environmental temperature was 81.4%which was significantly higher than that at 37℃（50.7%）（P<0.01）.At the temperature of 22℃，the volume changes of loading microdrops of CPA solution did not influence the survival rate significantly（85.7%，90.5%and 83.2%in<0.1，0.1-0.5 and>0.5-1.0 μL，respectively（P>0.05）.The survival rate seemed to be decreased with the increased treatment duration of oocyte in CPA solution（74.7%in>90-180 s，78.9%in>40-90 s and 83.3%in 30-40 s），but the differences did not reach to statistical significance（P>0.05）.ConclusionItwouldnotbenecessarytominimizetheCPAsolutiondrop'svolumeto lessthan 0.1 μL. Treatment duration of oocyte in CPA should not be too long，and inside 30～90 s has no significant effect on its survival.Controlling environmental temperature under 22℃can improve the survival rate of oocyte vitrification.

［Key words］Vitrification freeze；Mouse；Oocyte；Temperature；Volume；Treatment duration；Survival rate

人类卵子冷冻为需接受放化疗的肿瘤患者的生育能力保存，以及卵巢衰竭女性的卵源提供开辟了新的途径［1］，并可避免胚胎操作冻存引起的伦理和法律纠纷，在人类辅助生殖领域具有广阔的应用前景［2］。但卵母细胞体积大、细胞内水分含量高、含有纺锤体等特殊结构，故其对冷冻过程极为敏感，较胚胎冷冻更困难［3］，冻融复苏成功率也曾因此长期低下。传统的慢速冷冻可导致维持染色体结构的基因下调。mRNA保存率低［4-5］，而玻璃化冷冻技术对细胞内的水分扰动极小［6］，较之能更好地防止细胞内冰晶形成［7-9］，使卵子冻融复苏得以显著改善，已成为目前卵子冻存最主要的方法。目前常用的卵子玻璃化冷冻技术有弹射法、开放式拉伸麦管法（OPS）、封闭式拉伸麦管法（CPS）、石英毛细管法（QMC）、电镜铜网法和Cryotop法等［10］。其中Cryotop法因热传导效果更优异，被许多中心所采用。本研究应用Cryotop法对小鼠MⅡ期卵母细胞进行玻璃化冷冻，通过比较不同环境温度、不同微滴体积和暴露时间的复苏率，分析其对冻融效果的影响，为Cryotop法冷冻人类卵母细胞技术的改善积累经验。

1　对象与方法

1.1对象

1.1.1实验动物6周龄雌性昆明系小白鼠（体重20～25 g），购自浙江中医药大学实验动物中心（动物合格证号：SYXK（浙）2013-0184）。

1.1.2药物与试剂尿促性腺激素（HMG）与绒毛膜促性腺激素（HCG）均购自丽珠制药厂；透明质酸酶（hyaluronidas）及配子处理液G-GAMETE和G-IVF购自Vitrolife公司，二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）以及蔗糖均购自Sigma公司；人血清白蛋白（HSA）以及石蜡油购自Sage公司。

1.1.3耗材与设备四孔皿购自NUNC公司，60 mm培养皿及巴斯德管购自Falcon公司，装载工具Cryotop购自KITAZATO公司。超净工作台为丹麦IVFtech，解剖显微镜为日本OLYMPUS，培养箱为美国THEMRO，液氮罐为美国MVE。

1.2实验方法

1.2.1玻璃化冷冻解冻液的制备冷冻液分为浓度由低到高的4个梯度：预平衡液（95%DPBS+5%HSA）；冷冻液Ⅰ（85%DPBS+5%DMSO+5%EG+5%HSA）；冷冻液Ⅱ（75%DPBS+10%DMSO+10%EG+5% HSA）；冷冻液Ⅲ（25%DPBS+20%DMSO+20%EG+30%蔗糖+5%HSA）。解冻液则分为浓度由高到低的4个梯度：解冻液Ⅰ（65%DPBS+30%蔗糖+5%HSA）；解冻液Ⅱ（75%DPBS+20%蔗糖+5%HSA）；解冻液Ⅲ（85%DPBS+10%蔗糖+5%HSA）；解冻液Ⅳ（90% DPBS+5%蔗糖+5%HSA）。

1.2.2冻融前小鼠卵母细胞的准备雌鼠腹腔注射10 U的HMG，48 h后再注射10 U的HCG，15 h后将小鼠颈椎脱臼处死，用注射器于覆油的G-GAMETE配子处理液中刺破输卵管膨大部，挤出成簇卵冠丘复合物（cumulus-oocyte complexes，COCs）。置于37℃培养箱4 h后，将COCs放入含透明质酸酶的四孔皿内1 min，再移入剩余3孔的G-GAMETE配子外理液中反复吹打至颗粒细胞剥离干净，选取形态良好MⅡ期卵母细胞于G-IVF培养液37℃、6%CO2饱和湿度培养箱内培养1h待用。

1.2.3卵母细胞玻璃化冷冻复苏冷冻：根据冷冻环境温度的不同，分别设置37℃操作组和22℃操作组，即分别在生理温度（37℃）和室温（22℃）环境下，将卵母细胞依次放入事先热平衡过的预平衡液（2 min），冷冻液Ⅰ（2 min），冷冻液Ⅱ（3 min）以及冷冻液Ⅲ，且根据卵母细胞与含高浓度非渗透保护剂蔗糖的冷冻液（冷冻液Ⅲ）接触时间的不同，分别设置30～40s暴露组、>40～90 s暴露组、>90～180 s暴露组。将卵母细胞转移至Cryotop聚乙烯薄膜片前端，控制包被卵子的保护液微滴体积，根据薄膜上微滴体积的不同，分别设置<0.1 μL组、0.1～0.5 μL组、>0.5～1.0 μL组。完成以上操作后迅速将载具投入-196℃液氮中，插入管套储存。解冻：2 d后，将解冻液Ⅰ预先放到37℃培养箱预热1 h，其余解冻液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均置于室温下平衡40 min。解冻时，迅速从液氮中取出载杆，将前端载片浸入解冻液Ⅰ中，轻晃以使得卵子脱落，2 min内将卵子转移到解冻液Ⅱ，再分别将卵母细胞放入解冻液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各3 min，最后转移到G-IVF培养液，放于37℃、6% CO2饱和湿度培养箱后继续培养。

1.3卵母细胞存活判断

经解冻的卵母细胞放于培养箱内培养，次日早间观察依然可见透明带与细胞膜完整，卵周间隙清晰，大小正常，折光度好，且没有明显的胞浆溢出与皱缩，则判定其存活良好。

1.4统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1室温（22℃）操作环境下与37℃环境下小鼠卵母细胞复苏率比较

在其他实验条件相同情况下（加载CPA微滴体积< 0.1 μL，卵母细胞与高浓度CPA的接触时间<90 s），22℃操作组小鼠卵母细胞的复苏率高于37℃操作组，差异有高度统计学意义（P<0.01）。见表1。

表1　不同操作环境温度下小鼠卵母细胞复苏率比较

2.2加载不同体积CPA微滴组间小鼠卵母细胞复苏率比较

选择22℃的操作环境，卵母细胞与高浓度CPA的接触时间<90 s时，加载不同体积（<0.1 μL组、0.1～0.5 μL组、>0.5～1.0 μL组）的CPA微滴的小鼠卵母细胞复苏率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2　加载不同体积CPA微滴组间小鼠卵母细胞复苏率比较

2.3投入液氮前接触不同时间高浓度CPA的小鼠卵母细胞复苏率比较

在22℃的操作环境下，控制卵母细胞与高浓度CPA（冷冻液Ⅲ）的接触时间，使其分别为30～40、>40～90、>90～180 s暴露组，冻融后发现，>90～180 s暴露组复苏率低于30～40 s暴露组和>40～90 s暴露组，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3　投入液氮前接触不同时间高浓度CPA（冷冻液Ⅲ）的小鼠卵母细胞复苏率比较

3讨论

玻璃化冷冻操作温度的选择尚存在争论，巩晓芸等［11］通过冻融人卵裂期胚胎发现24-26℃的冷冻操作环境温度得到的复苏率为90%，要显著高于37℃组（55%），差异有统计学意义（P<0.05）。邹立波等［12］则发现在25℃操作环境下冻融小鼠囊胚后获得的孵化率为50.9%（28/55），显著高于37℃组的21.3%（13/ 61），差异有统计学意义（P<0.05）。但孙莹璞等［13］在37℃条件下玻璃化冻融小鼠GⅤ期和MⅡ期卵母细胞都能得到较高的复苏率分别为86.0%（129/150）和81.7%（121/145）。本研究分别在37℃和室温（22℃）冷冻操作环境下对小鼠成熟期卵母细胞进行冻融，发现室温（22℃）下操作较之37℃环境能获得更高的复苏率（P<0.01），与前两位学者的实验结果相一致。Rall等［14］认为降温可以减低高浓度CPA对胚胎造成的化学毒性，故本实验中37℃冷冻操作环境组复苏率不高的原因可能是由于更多的高浓度渗透性冷冻保护剂DMSO和EG进入到卵母细胞内，对其产生化学毒性作用。而卵母细胞与分裂期胚胎比较，其表面积与体积比例明显较小，细胞内含水量大，细胞膜渗透性低，且具有对温度极为敏感的纺锤体等特殊结构，这都使得卵母细胞显得更为脆弱，更易形成冰晶，玻璃化冻融难度更高［15］。因此，在冷冻过程中选择合适的操作温度（22℃）至关重要。

玻璃化是由液相直接转变为一种玻璃状的固体状态的过程［15］，避免了晶体态的出现，从而有效防止了冰晶对细胞的物理损伤。实现玻璃化状态的关键是提供足够快的降温速度，而降温速度又与冷冻载体的类型和液体体积有关。目前常用的卵子玻璃化冷冻载体有拉伸麦管，石英毛细管，电镜铜网和Cryotop聚乙烯薄片载杆，其能达到的降温速度分别为5521［16］、10 000［17］、3000℃/min［18］和37 500℃/min［16］。本实验选用以上4类载体中热传导降温效率最高的Cryotop载具对小鼠卵母细胞进行玻璃化冷冻，并通过比较加载不同体积的CPA微滴，来探讨液体体积这一因素对冻融效果的影响。结果发现，不同CPA液滴体积加载组间复苏率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。Kuwaya ma［19］提出Cryotop法时认为加载在塑料薄膜带（宽0.4 mm，长20 mm，厚0.1 mm）上的包含有卵母细胞的保护液小滴体积应<0.1 μL。但本实验结果提示，当液滴体积<1 μL时，液滴体积的增大并没有降低卵母细胞的复苏率，说明1 μL的CPA包被体积未达到影响胚胎复苏能力的阈值。而拉伸麦管法中，所用到的细麦管装载的液体体积达到2 μL，且脉管壁直接隔断了含配子的保护液与液氮的接触，阻止了热量的直接传导，但即便如此，其仍能达到5521℃/min的降温速率，并获得较好的冷冻效果。因此，本研究认为在使用Cryotop法进行玻璃化冷冻时，液滴体积不必刻意追求<0.1 μL，当体积<1 μL时，其大小改变不对复苏率造成影响。

玻璃化状态的实现，需要比传统慢速程序化冷冻所用浓度高得多的CPA的参与，但浓度的升高同时意味着CPA对卵子或胚胎毒性和渗透性损伤的增加［15］。因此，控制好配子与高浓度CPA的平衡接触时间，使其既满足玻璃化冷冻的需要，又尽可能减少CPA带来的毒性作用非常重要。杜娟等［20］收集IVF周期未受精人成熟卵子，将其分组后控制卵子与高浓度CPA的接触时间，发现10～20 s暴露组的复苏率要显著高于40～50 s暴露组（P<0.05）。但巩晓芸等［11］分别比较了2、4、8个细胞鼠胚以及人卵裂期胚胎和玻璃化液接触不同时间下的复苏率，发现各组胚胎复苏率比较差异无统计学意义（P>0.05）。本研究在22℃的操作环境下，控制小鼠MⅡ期卵母细胞与高浓度CPA的接触时间，发现30～40 s组和>40～90 s组的复苏率十分接近，这说明90 s的接触时间未达到影响卵子复苏能力的阈值。但>90～180s组的复苏率要低于>40～90 s组和30～40 s组，且许多卵子出现了过度脱水，体积皱缩，融解时细胞恢复缓慢甚至无法扩张到冷冻前体积的情况，这又提示过长的暴露时间的确会增加CPA对卵子的毒性和渗透性损伤，对卵子冻融不利。

综上所述，在采用Cryotop法对卵母细胞进行玻璃化冷冻时，要多因素综合考虑，选择合适的冷冻操作环境温度，加载恰当的高浓度CPA微滴体积以及控制适宜的卵子于CPA的暴露时间，以期达到最佳的玻璃化冻融效果。

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Effect of the temperature，volume and treatment duration of CPA microdrop on mouse oocytes vitrification

RAO Jinpeng1QIU Feng1LIU Qing1CAI Yiting1JIN Min1JIN Fan2
1.Reproductive Medicine Center，the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine，Zhejiang Province，Hangzhou310052，China；2.Reproductive Medicine Center，Women's Hospital，School of Medicine，Zhejiang University，Zhejiang Province，Hangzhou310006，China

R321

A

1673-7210（2016）09（c）-0008-04

2016-06-15本文编辑：任念）

国家自然科学基金资助项目（81571500）。

饶金鹏（1987-），男，硕士；研究方向：辅助生殖技术。

金帆（1958-），男，硕士，教授；研究方向：辅助生殖技术。