羟基红花黄色素A对胶质瘤U251细胞增殖、迁移与侵袭的影响

袁玉梅　楼亚玲

浙江省湖州市中心医院药剂科，浙江湖州313000

羟基红花黄色素A对胶质瘤U251细胞增殖、迁移与侵袭的影响

袁玉梅楼亚玲

浙江省湖州市中心医院药剂科，浙江湖州313000

目的研究羟基红花黄色素A（HSYA）对人脑胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并探讨其作用机制。方法体外培养人脑胶质瘤U251细胞，经不同浓度（25、100、400 μmol/L）HSYA处理后分别采用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）、划痕试验和Transwell试验观察HSYA对U251细胞增殖、迁移和侵袭的影响，采用Western blot方法检测基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的蛋白表达水平。结果与空白对照组比较，HSYA能降低U251细胞存活率，缩短细胞迁移距离，减少U251细胞穿膜数，差异均有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05），同时，HSYA能下调MMP-2、MMP-9的蛋白表达。结论HSYA对脑胶质瘤U251细胞增殖、迁移及侵袭等具有抑制作用，其作用机制可能与下调MMP-2、MMP-9表达有关。

羟基红花黄色素A；胶质瘤细胞；抑制作用

［Abstract］Objective To investigate the effects of hydroxysafflor yellow A（HSYA）on proliferation，migration and invasion of glioma U251 cells，and to explore its mechanism.Methods The human glioma U251 cells were cultured in vitro and treated with different concentrations of HSYA（25，100，400 μmol/L），then the methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay，scratch test and Transwell assay were used to observe the effects of HSYA on proliferation，migration and invasion of U251 cells respectively，and the expression levels of matrix metalloproteinase（MMP）-2 and MMP-9 were examined by Western blot assay.Results Compared with blank control group，the U251 cell viability in HSYA group was decreased，the migration distance was shortened，the number of penetrated cells was reduced obviously，the differences were all statistically significant（P＜0.01 or P＜0.05）.Moreover，HSYA could decrease the expression of MMP-2 and MMP-9.Conclusion HSYA has inhibitory effects for the proliferation，migration and invasion of glioma cells，and the mechanism may be related to the inhibition of MMP-2 and MMP-9 expression.

［Key words］Hydroxysafflor yellow A；Glioma cells；Inhibitory effect

神经胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，具有发病率、病死率和复发率高的特点。对于恶性胶质瘤的治疗，现阶段主要为手术切除，术后辅以放疗和化疗，但由于恶性胶质瘤的侵袭性强，术后容易复发，总体治疗效果不理想。羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）是中国传统中药红花中含量最高的主要活性成分，具有显著的药理活性［1］。近年来多项研究表明HSYA具有抗肿瘤作用［2-4］，本研究观察HSYA对胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭等作用，以及基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9等的表达情况，探讨HSYA对胶质瘤细胞的抗肿瘤作用及机制，为研究高效、低毒的中药抗肿瘤药物提供实验依据。

1　材料与方法

1.1细胞培养

胶质瘤U251细胞（中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库）用含10%胎牛血清MEM培养基（美国Gibco公司）于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.2MTT法测定U251细胞增殖

取对数生长期的U251细胞，以2×104个/mL密度接种于96孔板，贴壁24 h后，经不同浓度HSYA（25、100、400 mmol/L）（中国食品药品检定研究院，批号111637-201308）、阳性对照替莫唑胺（100 mmol/L）（Sigma公司）处理72 h，加入MTT液使终浓度为0.5 mg/mL，继续培养4 h后，弃去孔内液体，加入100 mL二甲基亚砜（DMSO）溶解蓝紫色复合物，震荡10 min，于酶标仪上490 nm波长处测定吸光度值（A490）。细胞存活率=处理组A490/对照组A490×100%。

1.3划痕试验检测U251细胞迁移

将对数生长期的U251细胞按照5×104个/mL密度接种于96孔板中培养，细胞贴壁后，用无菌100 mL枪头于细胞层中横向划线，形成宽度均匀一致的划痕，造成细胞伤口模型，在显微镜下拍照，测定划痕宽度。24 h后测定划痕宽度。使用Image软件测量划痕距离，每条划痕取3个测量点，计算平均宽度值。

1.4Transwell试剂盒检测U251细胞的侵袭能力

采用Transwell小室法构建侵袭模型，用无血清MEM将U251细胞浓度调整至5×105个/mL，取0.25 mL加入Transwell上室，同时进行药物干预（HSYA100mmol/L，阳性对照组替莫唑胺100 mmol/L），下室中加入0.5 mL含有10%胎牛血清的MEM。置细胞培养箱培养72 h后取出小室并弃去小室内液体，将小室置入0.1%结晶紫染色液中染色20 min，纯净水清洗后以棉签拭去小室滤膜上表面的细胞，干燥后使用200 μL醋酸脱色液脱色15 min，取100 μL至96孔板检测560 nm的OD值。

1.5Western blot检测MMP-2、MMP-9的蛋白表达

U251细胞经HSYA处理后，裂解细胞提取细胞总蛋白，BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。取30 μg蛋白质行10%SDS-PAGE电泳分离蛋白，电转膜后5%脱脂奶粉封闭1 h，加入兔抗人MMP-2、MMP-9单抗（Cell signaling公司，1∶1000）4℃孵育过夜，加入HRP标记的羊抗兔二抗（上海康成公司）孵育2 h，最终用X线胶片曝光分析。内参对照使用β-actin（上海康成公司）。

1.6统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间数据比较采用One way-ANOVA，组间比较采用Tukey法进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1HSYA对U251细胞增殖的影响

MTT法检测结果显示，与空白对照组比较，不同浓度的HSYA（100、400 mmol/L）能显著性降低U251细胞的存活率［分别为正常对照的（87.7±3.7）%与（77.0±3.7）%］，抑制U251细胞的增殖，并具有浓度依赖性。与阳性对照组替莫唑胺比较，高浓度的HSYA（400 mmol/L）对U251细胞有较强的抑制增殖作用，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见图1。

图1　HSYA对胶质瘤U251细胞增殖的影响

2.2HSYA对U251细胞迁移的影响

采用体外划痕法观察HSYA对U251细胞迁移能力的影响，划痕的宽度由于细胞的迁移变小，并逐渐融合。结果显示，与空白对照组比较，HSYA组细胞迁移距离减小，中、高浓度的HSYA组（100、400 mmol/L）U251细胞迁移距离分别为空白对照组的（88.8± 9.5）%与（75.4±17.5）%，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2），表明HSYA能抑制U251细胞的迁移。

图2　HSYA对U251细胞迁移能力的影响（400×）

2.3HSYA对U251细胞侵袭的影响

Transwell小室法检测结果（图3）显示，HSYA（100 mmol/L）组与阳性对照替莫唑胺组（100 mmol/L）相似，560 nm OD值较对照组明显下降，提示穿过Transwell小室滤膜的U251细胞数明显减少（图3），表明HSYA能降低U251细胞的侵袭能力。

2.4HSYA对U251细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与空白对照组比较，经HSYA干预处理的U251细胞MMP-2与MMP-9蛋白表达水平下调（图4），与阳性对照替莫唑胺结果类似，提示HSYA对U251细胞的抑制作用可能与MMP-2、MMP-9两种侵袭相关蛋白表达相关。

图3　HSYA对U251细胞侵袭能力的影响（200×）

图4　HSYA对U251细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

3　讨论

红花黄色素是中药红花发挥药理作用的物质基础，而HSYA是其中含量最高的活性成分，目前临床上主要因为其抗血小板聚集、保护心肌细胞等作用而广泛用于心脑血管疾病［5-7］。近年来较多研究表明红花黄色素具有抑制肿瘤作用，如胃癌［2，8］、肝癌［3］、乳腺癌［4］、肺癌［9］等。

但相关研究中，大部分多集中在HSYA对肿瘤新生血管生成的抑制研究上，如有研究结果表明，HSYA能通过抑制内皮细胞增殖与迁移等抑制肿瘤血管生成［10-13］。而对于HSYA在肿瘤细胞本身上的抑制作用研究较少，本研究在胶质瘤U251细胞中明确了HSYA的肿瘤抑制作用。结果表明，一定浓度的HSYA能显著性抑制U251细胞的增殖，且抑制作用呈浓度依赖性，与阳性对照替莫唑胺比较，HSYA对U251细胞的抑制作用不弱于替莫唑胺。

胶质瘤的高侵袭性是胶质瘤患者高复发的重要原因，而细胞的迁移及侵袭能力是影响细胞侵袭性的关键因素［14］。有研究表明某些中成药能通过抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭从而发挥抗肿瘤作用［15］。本研究通过划痕试验及Transwell侵袭试验提示，HSYA能有效抑制U251细胞的迁移与侵袭，随着浓度的增加，HSYA抑制U251细胞迁移的作用增强。

MMPs是一类降解细胞外基质蛋白的锌离子依赖蛋白酶，MMP-2和MMP-9为MMPs中的明胶酶，能降解血管周围基膜主要成分Ⅳ型胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白，利于肿瘤细胞沿基底膜侵入周围组织［16-17］。研究表明［18-19］，胶质瘤的高侵袭性与MMP-2及MMP-9的表达活性相关。近期有研究［20］显示，MMP-9与胶质瘤的分级相关，低表达的MMP-9在患者中具有更好的生存结果，同时对于胶质瘤化疗经典用药替莫唑胺具有更好的敏感性。因此，MMPs在胶质瘤中的表达对胶质瘤的侵袭以及化疗药物的反应性起重要作用。本研究结果发现，HSYA能显著性下调U251细胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表达，表明HSYA对胶质瘤U251细胞的抑制作用可能与下调MMP-2和MMP-9两种侵袭性相关蛋白的表达有关。而奚胜艳等［21］研究也发现HSYA能下调胃癌组织中MMP-9的表达。

综上所述，HSYA作为一种中药单体成分，对胶质瘤U251细胞的增殖、迁移以及侵袭均具有抑制作用，其抑制作用的机制可能与HSYA下调MMP-2和MMP-9的蛋白表达相关。本研究结论为进一步深入探讨HSYA对胶质瘤抑制作用的机制及为临床上探寻HSYA用于胶质瘤的治疗靶点提供实验依据，为寻找高效低毒的抗肿瘤中药成分提供新思路。

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Effects of hydroxysafflor yellow A on proliferation，migration and invasion of glioma U251 cells

YUAN Yumei LOU Yaling
Department of Pharmacy，Huzhou Central Hospital，Zhejiang Province，Huzhou313000，China

R739.41

A

1673-7210（2016）09（c）-0015-04

2016-06-03本文编辑：张瑜杰）

浙江省湖州市自然科学资金项目（2013YZ11）。

袁玉梅（1983-），女，硕士；研究方向：神经药理。