山慈菇提取物对结肠癌HT29细胞凋亡的影响

于林楠　翟宏颖

1.锦州医科大学附属第三医院肿瘤科，辽宁 锦州 121000；2.锦州医科大学附属第一医院中医科，辽宁 锦州 121000



山慈菇提取物对结肠癌HT29细胞凋亡的影响

于林楠1*翟宏颖2

1.锦州医科大学附属第三医院肿瘤科，辽宁 锦州 121000；2.锦州医科大学附属第一医院中医科，辽宁 锦州 121000

目的：研究山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞增殖及凋亡的影响。方法：采用MTT法检测山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞抑制率；流式细胞仪检测细胞凋亡率；Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3的影响。结果:不同浓度的山慈菇提取物对HT29细胞增殖均有抑制作用，且抑制率呈时间、剂量依赖关系；山慈菇提取物干预后诱导HT29细胞凋亡(P<0.01)差异有统计学意义；山慈菇提取物诱导细胞凋亡过程中的Cyt-C、Bax、Caspase-3蛋白表达明显增强，Bcl-2蛋白表达明显减弱(P<0.05)。结论:山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞有明显的促凋亡作用，其机制可能与上调Cyt-C、Bax、Caspase-3下调Bcl-2蛋白的表达有关。

山慈菇提取物；结肠癌HT29细胞；凋亡

结肠癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率逐年增高，随着手术、放疗、化疗等的进步，早中期结肠癌治疗效果明显提高，但对于中晚期、高龄及难手术患者缺少有效的治疗方法。目前，越来越多的医务科研工作者将目光投向天然动植物的研究，从中寻找可以防治肿瘤的有效成分，日渐成为临床抗肿瘤药物研究的热点[1-2]。山慈菇是常用的抗肿瘤中药之一，为兰科植物中杜鹃兰、独蒜兰及云南独蒜兰的干燥假鳞茎，具有解毒、化痰、散结等功效，临床上常以配伍用药的形式应用于各种肿瘤的治疗，其中包括结直肠癌[3]。现代药理研究表明，山慈菇具有抗肿瘤细胞生长、抑制血管生成、抗炎以及影响造血系统等作用，但其抗肿瘤的作用机制尚未完全阐明[4]。研究拟探讨山慈菇提取物对结肠癌HT29细胞凋亡的影响，以期为山慈菇运用于结肠癌的治疗提供实验依据。

1　仪器与材料

1.1仪器细胞培养箱MCO-175(日本Sanyo公司)；流式细胞仪6HT2L(美国Guava Easy Cyte公司)；BX50显微镜(日本Olympus公司)；超净工作台VD1320(哈尔滨东联技术开发有限公司)；高速冷冻离心机CR21(日本Hitachi公司)；凝胶成像仪及凝胶成像分析系统 GelDOC2000(美国Bio-Rad公司)。

1.2材料山慈菇提取物(沈阳药科大学植物化学教研室提供，纯度为98 %。称取50g山慈菇粉末先后加入500mL、400mL、300mL去离子水加热，冷却过滤，浓缩至200mL，加入95%乙醇冷藏洗涤，最后获得干粉6g，使用培养基配置成所需要的浓度)。胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)；RPMI1640 培养液(Gibco生物工程有限公司)；0.5%二甲基亚砜、MTT(DMSO，美国Sigma公司)；Annexin V/PI凋亡试剂盒(南京凯基生物技术有限公司)，Cyt-C抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体、Caspase-3抗体、β-actin、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗(美国Santa Cruz公司)；吸附(ELISA)试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)。

2　方法

2.1人结肠癌细胞HT29的培养将人结肠癌细胞株HT-29置于56℃、30min 10%胎牛血清、RPMI1640培养液中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，每2～3天传代一次，留取对数生长期的细胞用于实验。

2.2MTT法检测细胞抑制率取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化并收集细胞，以RPMI1640培养液调整细胞密度至1×105个/mL，接种于96孔培养板中，每孔0.1mL，在培养箱中培养24h使细胞贴壁。空白对照组加入培养基0.1mL，不同浓度的山慈菇提取物组以10、20、30mg/mL培养细胞24、48、72h后，吸弃各孔中培养液，每孔加入0.1mLMTT[含 5%磷酸盐缓冲液(PBS)]，在37℃下孵育4h后弃去上清，加入0.5%DMSO 0.1mL，振荡摇匀，室温放置10min。在0.1mL DMSO中发现蓝紫色的MTT甲臜沉淀物，使用ELISA法以酶标仪于490nm波长处测定OD值，计算细胞抑制率=(1-实验组OD值/空白对照组OD值)×100%。

2.3流式细胞术检测细胞凋亡取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化并收集细胞，以RPMI1640培养液调整细胞密度至1×105个/mL，接种于96孔培养板中，每孔0.1mL，移入培养箱中培养24h使细胞贴壁。以0(空白对照组)、10、20、30mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h后，每孔悬浮细胞用PBS洗2次，加入500μl Binding Buffer和FITC标记的AnnexinⅤ(20μg/mL)10μl和碘化丙啶(PI，50μg/mL)5μl，避光反应15min，采用流式细胞仪定量检测，计算凋亡率。2.4Western blot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达取对数生长期细胞，用RPMI1640培养液调整细胞密度至1×105个/mL，接种于6孔培养板中，每孔0.1mL，移入培养箱中培养24h使细胞贴壁。以0(空白对照组)、10、20、30mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h后，用裂解液抽提。根据蛋白提取试剂盒操作说明提取各组细胞总蛋白，将细胞的蛋白样品定量，变性；进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；转膜；脱脂牛奶封闭2h；洗膜，加入Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3 (稀释倍数1∶1000)的一抗以及β-actin(稀释倍数1∶1000)作为阳性对照，4℃过夜；加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1h，然后洗膜、风干；ECL发光显影。用凝胶图像分析系统进行数据分析。

3　结果

3.1细胞抑制率的测定MTT结果显示，随着时间与药物干预浓度的增加，山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞生长增殖的抑制率逐渐增加，差异有统计学意义(P<0.01)，并且抑制作用呈时间、剂量依赖关系。见表1。

表1　不同时间、浓度山慈菇提取物对细胞的抑制率　

注：与空白对照组比较，*P<0.01。

3.2细胞凋亡率的测定与空白对照组比较，10、20、30mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h后，细胞出现明显凋亡，并且随着山慈菇提取物浓度的增加，凋亡细胞的比例逐渐增大，差异有统计学意义(P<0.01)，并呈剂量依赖性。见表2。

表2　不同浓度山慈菇提取物对细胞的抑制率 ±s,n=12)

注：与空白对照组比较，*P<0.01。

3.3Western blot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、 Caspase-3蛋白表达的测定由图1可知，10、20、30 mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h 后，山慈菇提取物可使Cyt-C、Caspase-3、Bax蛋白表达增强，而Bcl-2蛋白表达减弱，差异有统计学意义(P<0.05)，并呈剂量依赖关系。

1.空白对照组；2.10mg/mL山慈菇提取物组；3.20mg/mL山慈菇提取物组；4.30mg/mL山慈菇提取物组图1　Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表达的测定结果

4　讨论

细胞凋亡是基因介导的主动发生的程序性死亡，在正常情况下细胞凋亡与增殖维持动态平衡[5]。细胞凋亡既可以出现在正常的生理过程中，也可以出现在多种疾病中，如肿瘤因关闭了线粒体的这一调控功能，使细胞凋亡减少出现细胞过度增殖现象[6]。因此肿瘤的发生不仅与细胞增殖失控相关，还与细胞凋亡密切相关[7]，中间牵涉很多促凋亡和抗凋亡细胞因子。随着对肿瘤细胞的凋亡和调控机制认识不断深入，选择性得抑制细胞增殖与诱导细胞凋亡是治疗恶性肿瘤的一个方向[8]。实验采用MTT法证明山慈菇提取物能够抑制人结肠癌HT29细胞的生长，并且抑制作用随着剂量的增加、时间的延长而增强。另外在细胞培养过程中，出现了大量的细胞凋亡，通过流式细胞仪检测的HT29细胞凋亡情况，结果表明，山慈菇提取物能够促进细胞凋亡，并且具有剂量依赖性。

凋亡是多基因严格控制的过程，包括Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因C-myc、抑癌基因P53等。而Caspase家族的凋亡途径包括两条：①死亡受体介导的外源性途径(Fas-FasL)；②线粒体介导的内源性调亡途径。而Bcl-2家族成员又与线粒体介导的凋亡途径密切相关[9]。研究表明：细胞在外界以及DNA损伤等内部信号的刺激下将Bcl-2家族中的成员聚集在线粒体，在促凋亡与抑凋亡因子的作用下调节细胞色素C(Cyt-C)的释放，在胞浆中其与凋亡相关因子结合形成多聚体，激活Caspase-9，再激活其下游的Caspase-3，细胞发生凋亡[10-11]。Bcl-2作为抑凋亡基因，在生长因子受体介导的信号传导途径中起作用，其通过抑制细胞凋亡而参与肿瘤的发病。而Bax则与其相反，它能促进细胞凋亡[12]。若Bcl-2过表达，则与Bax形成异二聚体抑制细胞凋亡，若Bax过表达，则形成同源二聚体促进细胞凋亡[13]。另外，研究提出Bcl-2/Bax比率关系细胞凋亡，当比率增大时，细胞凋亡受到抑制[14]。本实验通过Western-blot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、 Caspase-3在人结肠癌HT29细胞中蛋白的表达，来研究山慈菇提取物对细胞凋亡的影响。结果显示，山慈菇提取物通过提高Cyt-C、Bax、Caspase-3蛋白表达降低Bcl-2蛋白表达来诱导细胞凋亡。

综上所述，山慈菇提取物可以通过调节Cyt-C、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表达来抑制结肠癌HT29细胞增殖，诱导细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。但本实验处于初步探讨阶段，仍需进一步加强山慈菇的实验研究，发掘山慈菇在肿瘤治疗中的作用。

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(编辑：穆丽华)

Effects of Cremastra Appendiculata Extract on the Apoptosis of Human Colon Cancer HT29 Cells

YU Linnan1ZHAI Hongying2

1. Dept. of Oncology，the Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical Universiy，Jinzhou 121000，China；2.Dept. of Traditional Chinese Medicine，the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical Universiy，Jinzhou 121000，China

Objective To investigate the effects of Cremastra appendiculata extract on proliferation and apoptosis in human colon cancer HT29 cells.Methods Using the MTT assay to determine the cell inhibition rates on human colon cancer HT29 cells;the flow cytometry to determine the apoptosis rates;Western blot technology to determine the expressions of Cyt-C、Bcl-2、Bax and Caspase-3 protein.Results Cremastra appendiculata extract inhibited the human colon cancer HT29 cells in a time dependent and dose dependent manner. the apoptosis rates of the cells were increased after being cultured by Cremastra appendiculata extract; the expressions of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein were increased and the expression of Bcl-2 protein was decreased(P<0.05).Conclusions Cremastra appendiculata extract can induce the apoptosis of HT29 cells by a mechanism that may be related to increase the expression of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein as well as decrease the expression of Bcl-2 protein.

Cremastra Appendiculata Extract；Human Colon Cancer HT29 Cells；Apoptosis

2016-06-13

于林楠(1984-)，男，汉族，硕士研究生，医师，研究方向为胃肠道肿瘤。E-mail:yln-lll@163.com

R282.71

A

1007-8517(2016)16-0017-03