结直肠癌患者肿瘤组织中KRAS、NRAS和BRAF基因各亚型突变状况分析

郑宏江　尤雅坤　索成云

结直肠癌患者肿瘤组织中KRAS、NRAS和BRAF基因各亚型突变状况分析

郑宏江1尤雅坤2索成云3

目的分析结直肠癌患者肿瘤组织中KRAS、NRAS和BRAF基因各亚型突变状况。方法选取我院2014年6月至2015年6月期间就诊并经病理学检查确诊的结直肠癌患者82例作为本次研究对象，常规石蜡包埋组织，并使用甲醛固定，提取DNA组织，采取实时荧光定量PCR技术测定石蜡组织中KRAS基因、NRAS基因和BRAF基因突变情况。结果本组82例患者中，有34例（41.46%）检测到KRAS基因突变，其中12密码子突变26例（31.71%），包括G12A点突变4例（4.88%）、G12C点突变4例（4.88%）、G12D点突变12例（14.63%）、G12S点突变3例（3.66%）、G12V点突变2例（4.88%）、G12R点突变1例（1.22%）；有8例（9.76%）检测到KRAS基因13密码子突变，均为G13D点突变；有4例（4.88%）检测到NRAS基因突变，其中12密码子突变2例（2.44%），包括G12D点突变1例（1.22%）、G13D点突变1例（1.22%），检测到61基因突变2例（2.44%），包括Q61H点突变1例（1.22%）、Q61R点突变1例（1.22%）；有3例（3.66%）检测到BRAF基因突变，均为V600E点突变。结论KRAS基因在结直肠癌患者中的突变率较高，虽然NRAS基因和BRAF基因突变率较低，但临床不容忽视。通过KRAS基因、NRAS基因和BRAF基因检测，为临床结直肠癌患者的治疗提供重要参考信息。

结直肠癌；KRAS；NRAS；BRAF；基因突变

结直肠癌是我国常见的消化道肿瘤之一，发病率较高，位居我国恶性肿瘤第3位，仅次于肺癌、乳腺癌，且死亡率较高，占全部恶性肿瘤人数的6%～8%［1］。近年来，随着分子靶向药物治疗方案的应用以及精准化医学的问世，结直肠癌已进入靶向个体化治疗的新时期。国外多项研究表明，使用抗表皮生长因子受体（EGFR，epidermalgrow th factor）抑制剂西妥昔单抗或帕尼单抗治疗结直肠癌，其治疗有效性与下游基因RAS状态有关［2］。RAS基因是抗表皮生长因子信号转导通路中一个重要的下游控制基因，包括KRAS基因、NRAS基因。其中突变型的RAS基因不需抗表皮生长因子受体接受信号，不仅能自动激活该通路，同时能启动下游基因的转导，因此，RAS基因可影响抗表皮因子受体单抗治疗的疗效。同时，结直肠癌组织中其他下游基因如BRAF基因也会影响抗表皮生长因子受体单克隆抗体治疗的疗效［3］。本文就对结直肠癌组织中KRAS基因、NRAS基因、BRAF基因突变情况进行检测分析，旨在为临床治疗提供参考依据。

资料与方法

一、临床资料

选择我院2014年6月至2015年6月期间收治的结直肠癌患者82例，均经手术穿刺活检及病理学检查确诊，共取标本82份，均进行KRAS基因、NRAS基因、BRAF基因检测。本组患者均签署知情同意书，并经医院伦理委员会批准。

二、方法

1.仪器及试剂选择

选择美国Strategene公司提供的Mx300P实时荧光定量PCR仪器，选择上海创萌生物科技有限公司提供的B-500型核算蛋白质浓度测量仪，选择北京亚康博公司提供的FFDW样本DNA分离试剂盒，人NRAS基因突变定性检测试剂盒、人KRAS基因定性检测试剂盒及人BRAF基因突变定性检测试剂盒［4］。

2.DNA提取

应用FFDW样本DNA分离试剂盒进行DNA提取，行HE染色，在显微镜下，明确肿瘤区域，将提取的DNA组织常规石蜡切片，并使用甲醛固定，连续切片5张，厚度10μm，严格按试剂盒操作说明书进行。DNA提取后，采取紫外分光光度计测定所提取的NDA浓度及质量，将DNA浓度按1：100稀释至2～5mg/L备用［5］。

3.实时荧光定量PCR技术检测

以DNA为模板（2μL），上、下游引物各2μL，按照人NRAS基因突变定性检测试剂盒、人KRAS基因定性检测试剂盒及人BRAF基因突变定性检测试剂盒，应用M x3000P实时荧光定量PCR仪对提取的DNA组织进行PCR扩增，反应条件：在温度94℃条件下预变性5m in，在温度94℃条件下持续30 s，在56℃条件下持续45 s，在72℃条件下持续1m in，共45个循环；在温度72℃条件下延伸5m in，在4℃条件下冷却5m in，选择由北京迪诺基因科技有限公司提供的PCR扩增产物，严格按试剂盒操作说明书进行，根据说明书要求设立阳性和阴性对照，确定基因突变类型［6］。

结果

本组82例患者中，有34例检测到KRAS基因突变，所占比例为41.46%，其中有26例检测到12密码子突变，8例检测到KRAS基因13密码子突变。本组有4例检测到NRAS基因突变，所占比例为4.88%，其中12密码子突变2例，61基因突变2例。本组有3例检测到BRAF基因突变，所占比例为3.66%，均为V600E点突变，未监测到V600R点突变及V600D点突变；见表1。

表1 82例直肠癌组织中KRAS基因、NRAS基因、BRAF基因突变情况［n（%）］

讨论

近年来，随着社会的发展以及人们生活习惯的改变，结直肠癌的发病率呈逐年上升趋势，且死亡率较高，位居我国恶性肿瘤死亡第3位。目前，结直肠癌的治疗，一直是国内外学学者研究的热点。随着分子靶向治疗抗表皮生长因子受体，如帕尼单抗、西妥昔单抗药物的问世，同时在精准医学技术的指导下，结直肠癌的治疗已进入靶向个体化治疗的新时期。但有大量研究显示，抗表皮生长因子受体治疗结直肠癌的有效性受其下游基因RAS的影响，常见的基因类型有KRAS基因、NRAS基因等，上述基因均为抗表皮生长因子受体信号转导通路中一个重要的下游调控基因，当基因发生突变时，其无需接受抗表皮生长因子受体接受信号，可自动实现信号的转导，因此，突变型基因的患者采取抗表皮生长因子受体治疗无效，只有野生型RAS基因的患者，对抗表皮生长因子受体单克隆抗体的治疗有效。同时，其他下游基因如BRAF基因，对抗表皮生长因子受体单抗治疗也有一定影响［7］。故对结直肠癌组织中K RAS基因、NRAS基因、BRAF基因突变的检测，对临床治疗方案的选择有重要意义。

最新有大量研究表明，结直肠癌组织中RAS基因突变检测，已成为结直肠癌患者接受抗表皮生长因子受体治疗前的重要环节［8］。KRAS基因、NRAS基因、BRAF基因作为RAS基因家族成员，其与肿瘤的发生、进展有密切关系［9］。其中KRAS基因是抗表皮生长因子受体信号通路下游的重要调控基因，位于染色体上12p12.1，在相关信号转导通路中，如促进细胞的生长以及肿瘤血管的生成有重要调控作用［10］。有试验研究表明，帕尼单抗或西妥昔单抗药物联合化疗药物一线治疗野生型KRAS基因结直肠癌患者的有效率高达50%，而KRAS基因突变的患者治疗有效率为0［11］。因此，结直肠癌组织中KRAS基因突变，被认为是抗表皮生长因子受体单克隆抗体治疗疗效不佳的独立预后因素。国外研究报道，KRAS基因突变率为35%～40%。KRAS基因突变常发生于第2号外线至的第12密码子、第13密码子，其他位点有第3号外显子61密码子、59密码子、146密码子［12］。国外学者研究发现，结直肠癌组织中KRAS基因总突变率高达35.56%，其中G12A占2.34%，G12C占1.27%，G12D占12.79%，G12S占2.89%，G12V占9.43%，G13D占6.84%［13］。国外学者研究发现结直肠癌组织中NRAS基因总突变率为4.56%，但未见各亚型病例报道［14］。目前国内关于结直肠癌组织中NRAS基因突变情况的文献报道较少。本研究中，经统计结果显示本组共有34例（41.46%）检测到KRAS基因突变，其中12密码子突变26例（31.71%），包括G12A点突变4例（4.88%）、G12C点突变4例（4.88%）、G12D点突变12例（14.63%）、G12S点突变3例（3.66%）、G12V点突变2例（4.88%）、G12R点突变1例（1.22%）；有8例（4.88%）检测到KRAS基因13密码子突变，均为G13D点突变，未检测到G13C点突变；有4例（9.76%）患者检测到NRAS基因突变，其中12密码子突变2例（2.44%），包括G12D点突变1例（1.22%）、G13D点突变1例（1.22%），检测到61基因突变2例（2.44%），包括Q61H点突变1例（1.22%）、Q61R点突变1例（1.22%）；本研究结果与国外文献报道结果基本一致［15］。但本研究RAS基因未检测到罕见点突变位点。有学者研究发现，采取西妥昔单抗联合化疗药物一线治疗结直肠癌患者KRAS基因G12点突变患者的总生存时间明显长于其他类型的点突变，但与野生型KRAS基因患者的总生存时间相比，前者总生存时间较短［16］。有研究发现，采取西妥昔单抗联合化疗药物一线治疗携带KRAS基因突变G13D点突变的结直肠癌患者可取得较好效果，其治疗疗效与野生型患者相仿。目前国内外暂无NRAS基因突变预后生存的报道［17］。

NRAS基因作为RAF基因家族成员之一，在RAFMEK-EPK信号转导通路中发挥着重要作用，可调节肿瘤细胞增殖、分化及凋亡。多项研究表明，NRAS基因突变的结直肠癌患者，采取帕尼单抗或西妥昔单抗治疗可产生抵抗，NRAS基因突变是抗表皮生长因子受体单抗治疗疗效的独立预测因素［18］。国外学者研究发现，NRAS基因在结直肠癌组织中的突变率为5.61%，且均为V600E点突变。国内学者研究表明结直肠癌组织中NRAS基因突变率为4.05%，其中V600G点占0.03%，V600E点占3.95%，D594N占0.07%。本研究中，有3例（3.66%）检测到BRAF基因突变，均为V600E点突变，本研究结果与国内外文献报道基本一致［19］。有学者对结直肠组织中BRAF基因突变与耐药率进行相关性分析，发现西妥昔单抗联合化疗药物一线治疗携带有BRAF基因突变患者预后生存明显短于野生型BRAF基因患者［20］。

综上所述，KRAS基因在结直肠癌患者中的突变率较高，虽然NRAS基因和BRAF基因突变率较低，但临床不容忽视。通过KRAS基因、NRAS基因和BRAF基因检测，对结直肠癌的临床治疗及改善预后有重要意义。

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2016-05-12）

（本文编辑：王新颖）

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.04.011

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