结直肠癌错配修复蛋白和微卫星不稳定检测的对比分析

陈琼荣　王满香　郭芳　况晶　方娜　王明伟　金苏　吴德　邓云特魏少忠



•论著•

结直肠癌错配修复蛋白和微卫星不稳定检测的对比分析

陈琼荣1王满香1郭芳1况晶1方娜1王明伟1金苏1吴德1邓云特1魏少忠2

目的 目前最常用的筛查结直肠癌DNA错配修复基因缺失的方法是免疫组化检测错配修复（MMR）基因相关蛋白的表达，以及基于PCR检测多个微卫星位点判断有否微卫星不稳定（MSI）这2种方法，本研究主要目的是比较这二种检测之间的一致性，并对分子病理室作室内质量控制。方法 收集2014年8月至2015年10月湖北省肿瘤医院结直肠癌368例手术切除标本，免疫组化常规检测癌组织MLH1，PMS2，MSH2及MSH6这4种蛋白的表达。免疫组化显示任一蛋白完全缺失，判读为MMR蛋白缺失（dMMR）；如癌细胞4个MMR有多少不等的核着色，判读为MMR无缺失（pMMR）。选取其中的65例行PCR-毛细管电泳法检测MSI，其中28例为pMMR，37例为dMMR。然后对这65例组织用PCR毛细管电泳法检测Bethesda推荐的5个微卫星位点。比对这65例患者上述二种检测结果之间的一致性，并分析、整理其临床病理特征。结果 368例结直肠癌中有37例免疫组化结果为dMMR中，其余331例为pMMR。37例中剔除2例后对其中35例行毛细管PCR法检测，显示高频MSI者32例，微卫星稳定（MSS）者3例。选取331例中的28例行PCR检测，显示MSS者27例，MSI-H者1例。免疫组化法检测的敏感度和特异性分别为97.0%和90.0%，PCR检测结果的敏感度和特异性分别为91.4%和96.4%；二者总的一致性为93.7%。伴MSI的结直肠癌原发灶以右半结肠最多见（占48.6%），病理形态以低分化腺癌伴淋巴细胞浸润和粘液分泌最常见，病理TNM分期以Ⅱ期和Ⅲ期为主。结论 免疫组化检测MMR蛋白和基于PCR的毛细管电泳法检测MSI二者的一致性高，其中免疫组化法可以作为临床初筛结直肠癌微卫星不稳定性的一种经济而便捷的方法，值得推广。

结直肠肿瘤； 免疫组织化学； 微卫星不稳定； 错配修复蛋白

大约有15%的结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是经由微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）途径发生的，而DNA错配修复（mismatch repair，MMR）基因的表达缺失、引起DNA复制过程中错配累积是MSI发生的原因［1］。Lynch综合征是由MLH1、PMS2、MSH2、MSH6等MMR基因发生胚系突变所致的一种常染色体显性遗传病，除了发生结直肠癌外（约占全部CRC的2%～4%），还可发生子宫内膜癌、胆管细胞癌等肠外肿瘤［1-2］。如果由于MLH1基因启动子发生甲基化使该基因沉默、发生微卫星不稳定性而致的CRC，人们称之为散发性MSI性结直肠癌，约占全部CRC的12%左右［1，4］。

根据微卫星不稳定程度可分为：高频微卫星不稳定（MSI-H），低频微卫星不稳定（MSI-L）和微卫星稳定（MSS）。至少1个错配修复基因缺失（MMR deficient，dMMR），表现为MSI-H；错配修复基因无缺失（MMR proficient，pMMR）时表现为MSI-L或MSS［3-4］。TNM Ⅱ期或Ⅲ期的CRC伴MSI-H的患者预后更好，但接受5-FU为基础的辅助化疗并不获益，而对含奥沙利铂或伊立替康的化疗有效［5-6］。2015年新英格兰医学杂志报道了一组使用PD1抑制剂pembrolizumab治疗伴MSI-H的晚期、难治性结直肠癌患者，获得了惊人的效果，开创了这类患者接受肿瘤免疫治疗的先河，也使得临床普遍开展结直肠癌MMR或MSI检测更具临床意义［7］。

目前国内市场上已有商品化的、针对MLH1，PMS2，MSH2及MSH6这4种MMR蛋白的特异性单克隆抗体，自动化免疫组化仪器的广泛使用也使得这种检测结果稳定、可靠性强，因此包括湖北省肿瘤医院在内的国内多家大型三甲医院的病理科已常规开展这种免疫组化检测［8-9］。此外，分子病理室也能开展基于毛细管电泳的PCR法直接检测常见微卫星位点的不稳定性，为这类特殊类型的CRC筛查提供依据［8-9］。正是基于此背景，湖北省肿瘤医院病理科从2013年8月即开始对所有结直肠癌手术标本行免疫组化检测上述4种MMR蛋白，并选择dMMR和部分pMMR者行PCR毛细管电泳法检测MSI。本文既是对我们前一阶段的这两种检测结果的比对分析，以了解IHC与PCR的一致性、可行性以及经济实用性，也是对分子病理室的一次质控分析。

资料与方法

一、一般资料

收集湖北省肿瘤医院2014年8月至2015年10月手术切除的368例结直肠癌标本。一般资料包括性别，年龄及临床病理资料等。

二、方法

10%中性磷酸缓冲福尔马林液固定24 h～48 h，常规脱水、固定、石蜡包埋，免疫组化常规检测如下4种MMR蛋白（MLH1，PMS2，MSH2及MSH6）的表达。MLH1，鼠单抗，克隆号ES05，即用型；PMS2，兔单抗，克隆号EP51，即用型；MSH2，鼠单抗，克隆号FE11，即用型；MSH6，兔单抗，克隆号EP49，即用型，上述一抗均为DAKO产品。所用二抗是DAKO EnVisionTM二步法抗兔、鼠通用型免疫组化试剂，所用免疫组化仪是DAKO AutostainerLink 48。每张切片含有的正常肠黏膜、肿瘤间质细胞、炎症细胞作为内对照（核阳性着染）。依据文献判读免疫组化染色结果［10］：内对照细胞核阳性而癌细胞全阴性（即没有1个细胞核着色）时，表明该蛋白表达缺失。两个病理主治医师（王满香和郭芳）阅片，如果有分歧，请第三个高年资病理医师（陈琼荣，消化肿瘤亚专业）裁决。

在这368例接受MMR检测的病例中，选择dMMR者（37例），或有一项MMR蛋白表达弱于内对照、或患者年龄小于50岁、或有明显的家族史者（即部分pMMR），共28例，行PCR-毛细管电泳检测MSI：选取每例癌组织丰富的蜡块以及相应的远癌切端肠壁组织块做对照，每个蜡块切10张4 μm厚组织，刮取细胞丰富区，用Qiagen公司的石蜡组织DNA提取试剂盒（德国）提取DNA；采用上海源奇公司生产的MSI检测试剂盒扩增Bethesda推荐的5个标准微卫星位点（BAT25、BAT26、D2S123、D5S346及D17S250）［11-12］，其中BAT25、BAT26为单核苷酸重复序列，D2S123、D5S346、D17S250为双核苷酸重复序列。美国ABI公司的Applied Biosystems 3500基因分析仪检测荧光标志的PCR产物长度并用GeneMapperV4.1软件分析结果。如果这5个位点中有任何2个或以上的位点不一致（即≥40%），即评判为MSI-H；只有1个位点不一致，判为MSI-L；无位点偏移者判为MSS［11-12］。

收集上述做MSI检测的65例CRC患者的临床信息：患者年龄、性别、癌灶发生的部位，并显微镜下观察癌组织的分化程度、淋巴细胞浸润情况并按照美国癌症联合会（American Joint Committee On Cancer，AJCC）标准评估pTNM分期［13］。

结　果

一、MMR蛋白免疫组化染色结果

368例接受MMR蛋白免疫组化染色中，所有内对照（正常黏膜腺体和肿瘤间质成分）细胞核着色呈棕褐色，有37例癌组织中至少1种MMR蛋白完全不着色，判读为MMR蛋白缺失（dMMR）。其中1例放疗后直肠癌和另1例混合性腺神经内分泌癌被剔除，剩余35例dMMR。这35例中MLH1和PMS2联合缺失者21例（图1 A、1 B、1 C），MSH2和MSH6联合缺失者9例（图1 D、1 E、1 F），有3例显示PMS2单一缺失，2例显示MSH6单一缺失。

二、PCR-毛细管电泳法及与免疫组化检测结果一致性的分析

35例免疫组化检测结果为dMMR中，PCR检测显示MSI-H者32例（图2），MSS者3例。选取免疫组化显示无MMR蛋白缺失者（pMMR）28例作PCR-毛细管电泳法检测Bethesda推荐的5个微卫星位点，结果为MSS者27例，MSI-H者1例。我们假定PCR法检测结果为真，分析免疫组化法的敏感度和特异性分别为97.0%和90.0%，二者总的一致性为93.7%（表1）。从另一个角度分析，即假定IHC检测结果为真，分析PCR检测结果的敏感度和特异性分别为91.4%和96.4%，二者总的一致性为93.7%（表2）。

三、临床病理资料

上述63例既做了MMR又做了MSI检测的CRC患者中，男性患者43人，女性20人，男女之比约2：1。年龄27～84岁，中位年龄57岁。发病部位以右半结肠为主，免疫组化检测结果为dMMR的35例CRC患者中，右半结肠癌（其中升结肠癌和回盲部癌18例，横结肠癌2例）20例，占57.1%；其次是直肠癌8例，占22.9%；其他左半结肠（降结肠3例，乙状结肠4例）7例，占20.0%。35例dMMR结直肠癌中，以MLH1和/或PMS2缺失为主，共有24例（其中PMS2单一缺失3例）；而MSH2和/或MSH6缺失者只有11例（其中MSH6单一缺失2例）。这35例dMMR的CRC中，低分化或中分化腺癌伴明显肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）者13例，部分粘液腺癌13例（其中5例合并低分化腺癌），纯粘液腺癌3例，中分化或高分化腺癌且不伴黏液分泌、或不伴明显淋巴细胞反应者共11例。这35例CRC中病理TNM分期为I期者2例，II期者23例，III期者10例。

讨　论

用免疫组化检测结直肠癌MMR蛋白的表达以及PCR检测MSI位点的方法是WHO以及各类指南推荐的筛查Lynch综合征的方法，二者之间的一致性也很高［1-4，8-9，11-12，14-16］。湖北省肿瘤医院从2013年8月即开始对所有结直肠癌手术标本行免疫组化检测上述4种MMR蛋白的表达，并对其中dMMR或可疑Lynch综合征者行PCR毛细管电泳检测MSI以进一步确证MMR检测结果。对前一阶段这两种检测结果比对分析并复习文献后，我们发现二者之间的一致性高达93.7%，当然也发现了一些问题，为下一步改良我们的工作提供依据。

图1　A、B、C显示1例84岁女性患者右半结肠癌病理特征：A图显示低分化腺癌（HE 染色，×20倍）；B图免疫组化判读为PMS2缺失（IHC染色，×40倍）；C图免疫组化MSH6表达正常（IHC染色，×40倍）。D、E、F显示另1例27岁男性患者右半结肠癌病理特征：D图显示中分化腺癌伴粘液成分（HE染色，×100倍）；E图免疫组化判读为MSH6缺失（IHC染色，×100倍）；F图免疫组化MLH1表达正常（IHC染色，×40倍）

在368例手术切除的结直肠癌病例中，我们用免疫组化的方法筛查出37例MMR蛋白至少有一项完全缺失者，约占全部CRC病例的10.0%，低于国外文献的数据［17］，但与Ye等最近报道的中国结直肠癌人群的数据相当［18］。剔除其中放疗后直肠癌和混合性腺神经内分泌癌各1例后，只对35例进一步MSI检测和临床病理分析，发现最常见的是右半结肠癌占57.1%，这一点与文献报道一致［19］；而直肠癌位居第二，这可能与我国直肠癌发病率相对较高有关［20］。其他临床病理特征，如中-低分化腺癌伴淋巴细胞浸润、纯粘液腺癌或合并粘液腺癌、病理TNM分期以II期和III期为主等，与文献报道均相符［19，21］。此外，我们还发现37.1%的dMMR癌组织中伴有丰富的淋巴细胞浸润，这也为这类CRC今后接受肿瘤免疫治疗提供了证据［7，22-23］。

对比分析免疫组化检测MMR与PCR-毛细管电泳法检测MSI的结果，发现二者敏感度和特异性均在90%以上，二者之间的一致性高达93.7%。相对而言，免疫组化的敏感度高于PCR，而特异性相反。我们的结果与大多数文献一致［4，15，19，21］。因此，用简便而经济的免疫组化检测结直肠癌组织MMR蛋白可作为一种初筛的手段，易于在各病理实验室开展［15］。但我们在核查检测结果的时候，发现有3例初始IHC检测判读为dMMR，做PCR检测发现是MSS，然后复阅IHC切片，发现有2例内对照阳性很弱，后重复IHC检测后判读为pMMR；另1例仅有不足10%的癌细胞阳性但阅片时漏诊而致假阴性判读。复习文献发现也有类似的报道［10，15，24］。因此，为了得到可靠的MMR免疫组化检测结果，我们认为必须注意如下几点：（1）选择带正常肠黏膜且癌组织丰富的切片做IHC染色；（2）加强免疫组化技术的质量控制，从标本的切开、固定、到免疫组化操作过程（比如一抗的修复和浓度的摸索、DAB显色时间的控制等），均需严格质控［25］；（3）最好由相对固定的、认真负责且经验丰富的消化病理医师阅片判读IHC结果［24］。

我们检测的35例dMMR结直肠癌中，以MLH1和/或PMS2缺失最为多见（24例），这与文献也是相符的［15，21，26］。另外，我们还发现MSH6单缺失有2例，其中1例是MSI-H，1例是MSS。文献报道［27-30］孤立性的MSH6蛋白缺失时，由于其功能冗余，可能不足以导致MSI的发生；因此我们的检测结果验证了这一点，同时也说明PCR检测微卫星不稳定性的敏感度难以达到100%，正如免疫组化检测MMR缺失的敏感度也只有97.0%一样［15］。

图2　显示1例57岁男性患者乙状结肠癌组织和相应的正常远癌切断组织的PCR毛细管电泳法检测Bethesda推荐的5个微卫星位点的检测结果，红色箭头显示癌组织的4个位点（D5S346，Bat-25，D17S250和Bat-26）相较于正常切端组织发生了位点偏移，判读为MSI-H

表1　免疫组化检测MMR蛋白比对PCR检测MSI的分析（例）

表2　PCR检测MSI比对免疫组化检测MMR蛋白的分析（例）

因此，到目前为止，大多数文献报道的MMR和MSI的检测都不能达到100%的敏感度和特异性（相对于基因突变分析而言），但人们总在努力降低其假阴性和假阳性率，特别是针对花费比较高的MSI检测。目前我们分子病理室选用的是Bethesda推荐的5个位点，但有很多文献推荐检测5个单核苷酸位点、6个甚至10个单和双核苷酸位点的MSI检测法，可以提高其敏感度和特异性［4，8，26，31-34］。此外，有学者提出用显微切割技术选择癌细胞丰富区做PCR，特别是对粘液腺癌的病例意义重大［34］；我们有1例粘液腺癌做免疫组化显示很肯定的dMMR，但PCR检测为MSS，我们推测这可能是由于送检的癌组织量没有达到70%而导致PCR检测MSI假阴性的发生。

虽然我们客观真实的总结了我们的数据以期跟同行分享我们的经验，但本文也有明显的局限性：（1）由于我们病例选择有限，因此我们得到的数据可能存在偏倚；（2）PCR选择的Bethesda推荐的5个位点，BAT25，BAT26是单核苷酸重复序列，另三个是双核苷酸重复序列；而文献建议检测5个或6个的单核苷酸位点或单核苷酸联合双核苷酸的10个位点的PCR检测［4，8，26，31-34］，可以明显提高MSI检测的敏感度和特异性。因此，下一步，我们将以本文的数据为依据，更新我们的MSI检测；（3）本文中配对检测MMR和MSI的63例结直肠癌组织没有行相关基因测序分析，因此，对这两种检测结果的比对分析缺乏一个金标准，所得出的分析数据可能存在偏差；（4）对可疑Lynch综合征的患者，我们只收集了其中部分患者的家族史信息，缺乏完整的家系调查结果，这也影响了本文分析的深度和广度。

总之，本文是对我院病理科免疫组化检测结直肠癌MMR蛋白、PCR-毛细管电泳法检测MSI的一组对比分析，显示这两种方法检测结果的一致性高达93.7%，二者相对的敏感度和特异性均达90%以上。其中免疫组化经济、简便，易于推广，而且可以揭示缺失的基因种类，有利于下一步基因测序分析。此外，做好免疫组化和PCR检测的质控和技术更新，加强对相关技术人员和医师的培训，尽量降低假阴性和假阳性的比率，这样可望提高结直肠癌患者MMR/MSI的检测的准确性。

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Testing mismatch repair proteins versus microsatellite instability in colorectal carcinoma

Chen Qiongrong1，Wang Manxiang1，Guo Fang1，Kuang Jing1，Fang Na1，Wang Mingwei1，Jin Su1，Wu De1，Deng Yunte1，Wei Shaozhong2.1Department of Pathology；2Department of Gastrointestinal Surgical Oncology，Hubei Cancer Hospital，Wuhan 430079，China

Wei Shaozhong，Email: weishaozhong@163.com

Objective Immunohistochemical（IHC） staining for mismatch repair （MMR） proteins and PCR-based detection for microsatellite status are routinely performed on colorectal carcinoma （CRC）surgical samples.However，the concordance of the two detections，which is related to the quality control of our molecular pathology laboratory，is unknown so far.So the main aim of this study is to compare the differences between the two analyses and to improve our work.Methods IHC analyzed the expression of MLH1，PMS2，MSH2 and MSH6 which was performed on 368 cases of formalin-fixed paraffin-embedded（FFPE） CRC tissues.If any one protein is negative in all of cancer cells but positive in normal colorectal mucosa，the IHC staining was reported as mismatch repair defective （dMMR）.If the four MMR proteinsare expressed in the nucleus of one or more cancer cells，the IHC result was interpreted as mismatch repair proficient （pMMR）.All of the 37 cases of dMMR and selected 28 cases of pMMR were tested by PCR-based MSI analysis.Paired normal and cancer DNA samples isolated from the FFPE tissues were tested for MSI using Bethesda recommended 5 markers （BAT25，BAT26，D2S123，D5S346，D17S250）.At last the results of IHC and PCR were compared and their concordance were analyzed.Results IHC analyses were performed on 368 cases of CRC，among which 37 cases were dMMR and 331 cases were pMMR.After excluding 2 cases from the 37 samples，the remained 35 samples were tested for MSI，among which 32 samples were high-level microsatellite instability （MSI-H） and 3 samples were microsatellite stable （MSS）.In addition，28 cases of pMMR samples were selected to be tested by PCR for MSI，among which 27 cases were MSS but one case was MSI-H.The sensitivity and specificity of immunohistochemistry was 97.0% and 90.0%，separately，the sensitivity and specificity of PCR was 91.4% and 96.4%，separately，and the total concordance of the two detections achieved 93.7%.The most common original site of dMMR CRC was right hemicolon （occupying 48.6%），and the most common pathological features included mucous adenocarcinoma，poor differentiated adenocarcinoma with lymphocytes infiltration，and pathologic TNM stage Ⅱ and stage Ⅲ.Conclusions The total concordance of the immunohistochemistry for MMR proteins and PCR-based MSI testing achieved 93.7%，and the former is an economic and quick screening method which is deserved to be popularized in China.Moreover，we have to emphasize the important role of intra and external laboratory quality control of the two methods and then to improve the process，so as to increase the testing accuracy.

Colorectal neoplasms； Immunohistochemistry； Microsatellite instability；Mismatch repair proteins

2016-05-15）

（本文编辑：关旭）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2016.05.006

湖北省卫生厅重点资助项目（No.JX6A06）；湖北省自然科学基金重点资助项目（No.2013CFA078）；湖北省自然科学基金资助项目（No.2013CFC022）

430079 湖北省肿瘤医院病理科1；湖北省肿瘤医院胃肠肿瘤外科2

魏少忠，Email：weishaozhong@163.com

陈琼荣，王满香，郭芳，等.结直肠癌错配修复蛋白和微卫星不稳定检测的对比分析［J/CD］中华结直肠疾病电子杂志，2016，5（5）：398-404.