镧系铕配位羧甲基壳聚糖止血海绵的研究

王晓晨，李红梅，张伟伟，郈秀菊

(山东省药学科学院，山东省医用高分子材料重点实验室，山东 济南 250100)

1 引 言

羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)为天然高分子多糖-壳聚糖羧甲基化的衍生产物[1-3]。羧甲基壳聚糖不但改善了壳聚糖的水溶性，而且增强了抑菌活性[3-4]。改性后多糖分子结构上存在羧甲基使羧甲基壳聚糖还可以作为一种有机配体，当该配体的三重态能级和镧系金属铕离子(Eu3+)的共振发射能级匹配时，就能存在一个高效能量传递的过程，发射出红色特征荧光，具有优良的发光性能[5-8]。镧系金属元素在医药领域广泛应用于抗血栓药物、抗炎药物等[9-10]，但是用于标记伤口感染和光学显示的医用敷料领域鲜有报道。

本研究以羧甲基壳聚糖与镧系金属铕水合物进行配位，复合其他医用辅料，经发泡和冷冻干燥工艺制备得到镧系铕配位羧甲基壳聚糖止血海绵。该敷料表面多孔，且孔隙均匀，具有优良的止血抑菌性和特征荧光性能。

2 材料与方法

2.1 原料试剂

羧甲基壳聚糖(CMCS)购于青岛弘海生物技术有限公司，脱乙酰度90%；氧化铕(Eu2O3)，吐温80(T80)购于国药集团化学试剂有限公司；浓盐酸(HCl)、四氢呋喃、乙醇、甲醇、丙酮均为分析纯，购于天津市大茂化学试剂厂；丙三醇、丙二醇均为分析纯，购于天津市富宇化学试剂厂；大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌购于山东省疾病预防控制中心；沙氏培养基购于杭州天和微生物试剂有限公司；营养琼脂培养基购于上海源聚生物科技有限公司。

2.2 仪器设备

荧光分光光度计：Perkin Elmer 公司 LS-55型；真空干燥箱：上海树立仪器仪表有限公司 ZKXF型；SM-7800F超高分辨率场发射扫描电子显微镜(SEM)：日本JEOL电子株式会社。

2.3 实验方法

称取一定量的Eu2O3溶于浓盐酸制备六水合氯化铕(EuCl3·6H2O)[5-8]。

按照原料质量配比1∶1称取CMCS和EuCl3·6H2O，溶于25 ml四氢呋喃磁力搅拌反应4 h。加入50 ml甲醇回流0.5 h，过滤后分别用甲醇、水、丙酮洗涤3次得粗产品。将粗产品加入20 ml四氢呋喃和50 ml甲醇混合溶液，回流1 h，重复上述洗涤过程[5-8]。洗涤产物放入真空干燥箱中，55℃干燥10 h，得到产物镧系铕配位的羧甲基壳聚糖粉末，简称为CMCS-Eu,收率92%～95%。

取8 g CMCS-Eu粉末，加入2.5 g丙三醇、1 g丙二醇、0.5 g T80，88 g去离子水，高速机械发泡1 h，-70℃冷冻1 h，-45℃冷冻干燥10 h，得到镧系铕配位羧甲基壳聚糖止血海绵[11]，简称为CMCS-Eu止血海绵。

3 结果与讨论

3.1 扫描电镜(SEM)分析

图1为CMCS-Eu止血海绵的扫描电镜图片，敷料为多孔层状，呈分散和聚集态的物理形貌为其应用于大量吸液、快速止血的医用敷料提供了基础[5-6,11]。

图1 CMCS-Eu止血海绵的SEM图像

3.2 吸液倍率测试

称取CMCS-Eu止血海绵 0.5 g，置于洁净干燥的培养皿中，称重m1，加入适量试验液[12]待吸液饱和后，倒出多余试验液，称重m2，根据公式(1)计算吸液倍率(A)，经多次测试后，吸液倍率为30～33倍。

A=(m2-m1)/0.5

(1)

3.3 荧光光谱分析

CMCS-Eu止血海绵的激发光谱见图2。通过检测含铕复合材料在617 nm 处的发射强度随激发波长的变化而测定激发光谱。CMCS-Eu止血海绵在275 nm处呈现出一个宽吸收峰，该现象证明铕离子发生了配位[5-8]，故显示出Eu3+与CMCS的羧甲基存在能量传递，该材料具备发光性能。

图2 CMCS-Eu止血海绵的激发光谱

在298 K，275 nm波长的紫外光激发可检测到铕离子红色发射光谱。含铕敷料的发射波长分别对应于Eu3+离子的三重态能级至不同单重态能级之间的跃迁，分别是5D0→7F1跃迁(590 nm处)，5D0→7F2跃迁(616 nm处)[5-8]。说明CMCS的羧甲基基团与Eu3+离子间存在有效地能量传递过程。

图3 CMCS-Eu止血海绵的发射光谱

3.4 大鼠背部止血实验

选取6只280～320 g健康Wistar大鼠，雌雄各半，随机分为3组，每组2只大鼠，分别是空白对照组、纱布包扎组和CMCS-Eu止血海绵组。大鼠麻醉固定于手术台，背部去毛、消毒后，切取1cm×1cm的皮肤，待血液充满创面，根据分组采取敷压止血措施，记录止血时间，观察敷料与创面的粘合情况。结果见表1，CMCS-Eu止血海绵组能在较短时间内止血，流血量少，可以粘结附着创面，凝血效果好，能有效达到止血目的。

表1 CMCS-Eu止血海绵的大鼠背部止血实验结果

3.5 抑菌试验

以CMCS-Eu止血海绵为抑菌试样，分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌进行抑菌试验[1,4]。将CMCS-Eu止血海绵剪成直径6 mm圆形片经辐照灭菌、干燥，浸于营养琼脂、沙氏培养基4 min，吸饱和后作为备用试样。将浸有无菌水的滤纸片作为空白试样进行对照。

所用器皿均需无菌，操作过程保证在无菌环境中进行。将三种供试菌分别均匀涂布在含营养琼脂、沙氏培养基的培养皿中，再用无菌眼科镊子将备用试样和空白试样贴于上述涂布菌种的培养基上，置37℃培养18～24 h，观察、测量并记录抑菌圈大小。

抑菌试验结果见表2。通过抑菌试验可知，CMCS-Eu止血海绵对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌均有一定的抑菌作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌作用略高于枯草杆菌和大肠杆菌。

表2 CMCS-Eu止血海绵的抑菌圈直径(mm)

4 结论

羧甲基壳聚糖分子结构上的羧甲基与镧系金属铕盐配位，复合其他医用辅料制备得到镧系铕配位羧甲基壳聚糖止血海绵。

该止血海绵呈多孔洞和大粒径的物理形貌能大量吸液、快速止血，吸液率可达到30～33倍，用于大鼠背部止血实验时，能迅速止血，粘结附着创面，凝血效果好，具有优异的吸液止血性能。该止血海绵对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌均有一定的抑菌作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌作用略高于枯草杆菌和大肠杆菌。而且Eu3+与CMCS中的羧甲基存在有效的能量传递过程，能发出红色特征光，赋予该止血海绵良好的荧光性能。

该止血海绵既具有羧甲基壳聚糖良好的吸湿抑菌性，兼具镧系铕配合物稳定的发光性能，可用于创面止血、抑菌，还可用于特殊标记伤口感染区域和特征光学显示等。该材料拓宽了壳聚糖伤口护理敷料的应用，在外科手术和家庭护理等方面具有很好的前景。