SBC法测定金花葵黄酮的含量

陈亮，辛秀兰，李晔，王晓杰，冯晖

（北京电子科技职业学院生物工程学院，北京100176）

SBC法测定金花葵黄酮的含量

陈亮，辛秀兰*，李晔，王晓杰，冯晖

（北京电子科技职业学院生物工程学院，北京100176）

对金花葵植株各部分干花、果、叶、茎及金花葵产品酒、油中总黄酮含量进行了研究。以芦丁为标准品，采用新方法-硼氢化钠/氯醌（SBC）比色法对金花葵各样品总黄酮含量进行了测定，试验结果表明，金花葵植株各部分及产品中总黄酮含量在62.0 mg/g～229.0 mg/g之间，其中金花葵干花总黄酮含量最高，可达228.19 mg/g，为开发金花葵产品提供参考。

金花葵；总黄酮；硼氢化钠/氯醌（SBC）比色法

金花葵（Hibiscus manihot L.）又名菜芙蓉，野芙蓉，为一年生草本锦葵科秋葵属植物。自然分布在河北、河南地区，是近濒临绝种的植物之一。因其功效渐被人知，目前已经有很多金花葵种植基地，多分布在太行山东部山麓地区，晋中晋南地区。

金花葵含有丰富的蛋白质、游离氨基酸、VC、VA、VE、和磷、铁、钾、钙、锌、锰等矿质元素及由果胶和多糖等组成的粘性物质。故金花葵被称为植物大熊猫［1］。金花葵珍贵之处在于全株无一处废物，芽、苗、嫩尖、花蕾、嫩果均可作为新品种特菜供应市场，家庭及饭店可炒、过水凉拌、做汤等，浑素皆宜。此外，它还属于药膳同用植物，既可入药，又是一种很好的营养保健品。

金花葵含有极为丰富的黄酮类化合物，是黄酮类化合物提取的较佳原料。黄酮类化合物具有超强的抗氧化能力，在维护人循环系统正常功能方面起着特殊作用，可使肌肤保持弹性，消除或抑制皱纹褐色斑的产生。越来越多的证据表明，生物类黄酮物质通过清除自由基、保护细胞组织，达到增强人体免疫力。可以保护人体免受自由基氧化导致的心脏病和癌症等60余种疾病的发生。其丰富的天然植物雌激素，对于延长女性青春期，减轻或避免中老年更年期综合症也有奇效。金花葵也含有丰富的金丝桃苷成分，而金丝桃苷具有明显的抗炎作用，有较强的止咳作用，另外，还具有较强的抑制醛糖还原酶的作用［2-5］。金花葵根茎叶及干花简单加工成花草茶或直接提取金花葵生物黄酮，或进一步加工成保健品和药品。

因此，定量测定金花葵中总黄酮的含量具有重要意义。目前，有三种常用于测定总黄酮含量的方法：Folin-Ciocalteu（F-C）比色法、亚硝酸钠-氯化铝比色法和高效液相色谱法［6-8］。Folin-Ciocalteu（F-C）比色法是最为常见测定酚类成分的方法之一，广泛用于测定果蔬中的总酚含量，但是，它对于黄酮类成分含量测定的专一性不强，只要是带有活性羟基的化合物，如酚酸、黄酮、抗坏血酸、还原糖、还有一些氨基酸和芳香胺类成分，都可测得。而高效液相色谱法专一性和灵敏度都高于比色法，但是它需要可用的标准品和液相色谱的分离度的要求，限制高效液相色谱法的应用。现阶段最常用于总黄酮测定的方法是亚硝酸钠-氯化铝比色法，但是测得的数据受限于该方法只能测定黄酮类成分中的黄酮、黄酮醇等成分，而对于黄烷酮、黄烷醇、花色素等成分无法测定，因此该方法仍具有一定的局限性。

本文采用Xiangjiu He等［9］开发的一种总黄酮测定新方法-硼氢化钠/氯醌（SBC）比色法，避免了亚硝酸钠-氯化铝比色法的局限性，方法反应机制如图1，带有4-羰基的黄酮类成分，如：黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇和异黄酮类成分，可被硼氢化钠还原成黄烷-4-醇，该反应加入氯化铝催化可得到很高产量的黄烷-4-醇；黄烷醇类可被乙酸溶液中的氯醌氧化成花色苷类成分。花色苷类成分再加入香草醛和浓盐酸可在490 nm处用分光光度计进行定量。

图1　SBC法测定总黄酮的主要化学反应机理Fig.1Main chemical reactions of the SBC total flavonoid analysis

本文以芦丁为标准品，采用硼氢化钠/氯醌（SBC）比色法对金花葵干花、果、叶、茎、酒和籽油中的总黄酮含量进行了测定，为进一步研究金花葵中有效成分及开发金花葵产品提供参考。

1　材料

金花葵原材料及产品：均由河南平顶山军昊农业有限公司提供，生产日期为2015年10月。

金花葵原材料有新鲜金花葵植株不同部位茎、叶、果和干花；金花葵产品有金花葵酒及金花葵籽油。

1.2试剂

硼氢化钠、氯醌、四氢呋喃、乙醇、三氯化铝、冰醋酸、盐酸和香草醛，均为分析纯：购自北京化工厂。

1.3仪器

9960A超声提取清洗机：美国CBL光电子技术有限公司；豪威斯AR5120型电子天平：北京天平医用厂；Laborato 4000 efficient旋转蒸发仪：德国海道夫仪器有限公司；日立高速离心机CR-GIII：天美科学仪器有限公司；UV-1800紫外分光光度计：北京彭曼科技有限责任公司。

1.4方法

1.4.1提取工艺

将金花葵干花、果、叶、茎剪碎，各取剪碎后的金花葵原材料1 g，分别置于烧杯中，按照料液比为1∶35（g/mL），加入60%乙醇水溶液，90℃提取4 h，取提取液经真空浓缩至棕色浸膏状后，再用四氢呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，体积比）溶解并定容于25 mL比色管中，3 000 r/min离心15 min，取上清液为样品，4℃保存备用［4］。

取适量金花葵酒，经真空浓缩至棕色浸膏状后，再用四氢呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，体积比）溶解并定容于25 mL比色管中，3 000 r/min离心15 min，取上清液为样品，4℃保存备用。

取适量金花葵籽油直接用四氢呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，体积比）溶解并定容于25 mL比色管中，3000r/min离心15min，取上清液为样品，4℃保存备用。

1.4.2SBC法测定总黄酮含量［10］

1.4.2.1标准曲线

称取对照品芦丁33 mg溶于四氢呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，体积比）中，定容至5 mL，芦丁浓度为6.6 mg/mL，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL于6个比色管中，标记后依次分别加入1、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL四氢呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，体积比）稀释摇匀，浓度平均分布在（0.1 mmol/L～10.0 mmol/L）内，再分别加入0.2 mL四氢呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，体积比），然后加入50 mmol/L的硼氢化钠0.5 mL和74.6 mmol/L的三氯化铝0.5 mL，室温振荡30 min，分别再次加入5 050 mmol/L硼氢化钠0.5 mL，室温振荡30 min。然后加入2 mL预冷的0.8 mol/L的冰醋酸，避光振荡15min。再加入20 mmol/L的氯醌1 mL，加热至100℃保持1 h，冷却后加入1 052 mmol/L的香草醛1 mL，混合后加入12 mol/L的盐酸2 mL，避光振荡反应15 min后进行紫外扫描，最大吸收波长为510 nm［5］。以零管做空白，在510 nm处测定吸光度，以各管浓度为x轴，以吸光度A为y轴进行线性回归，得到回归方程为y=1.171 6x+ 0.018 7，相关系数R2=0.998 4。芦丁测定质量浓度的线性范围为0.15 mg/mL～0.76 mg/mL。

图2　芦丁标准曲线图Fig.2The standard curve of rutin

1.4.2.2精密度试验

取对照品溶液适量，按照1.4.2.1加入显色剂，连续测定6次，记录吸光度值A。芦丁测定的RSD为0.97%（n=6），表明方法的精密度良好。

1.4.2.3稳定性试验

取对照品溶液适量，按照1.4.2.1加入显色剂，反应完毕，分别放置0、10、20、30、40、50、60 min进行吸光度值测定，结果的RSD为1.36%（n=7），表明方法的稳定性良好。

1.4.2.4加样回收率试验

取已知含量样品试样，分别加入一定体积已知浓度对照品芦丁溶液，按照1.4.2.1加入显色剂，反应完毕，测定吸光度值，计算样品含量及加样回收率，结果方法的平均加样回收率为97.39%，RSD为2.33%（n=6）。

1.4.2.5样品含量测定

分别吸取0.5 mL样液于比色管中，加入0.5mL四氢呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，体积比）与标准溶液体积相同，再加入0.2 mL四氢呋喃-乙醇混合溶液（1∶1，体积比），然后加入50 mmol/L的硼氢化钠0.5 mL和74.6 mmol/L的三氯化铝0.5 mL，室温振荡30 min，再次分别加入5 050 mmol/L硼氢化钠0.5 mL，室温振荡30 min。再加入2 mL预冷的0.8 mol/L的冰醋酸，避光振荡15 min。再加入20 mmol/L的氯醌1 mL，加热至100℃保持1 h，冷却后加入1 052 mmol/L的香草醛1 mL，混合后加入12 mol/L的盐酸2 mL，避光振荡反应15 min后进行紫外扫描，最大吸收波长为510 nm。以零管做空白，在510 nm处测定样品溶液的吸光度，可利用标准曲线的回归方程，计算出金花葵各样品的总黄酮含量。

2　结果与讨论

本文采用硼氢化钠/氯醌（SBC）比色法测定金花葵干花、果、叶、茎、酒、籽油各样品溶液3次，取平均值，测定结果图3。

图3　样品测定结果图Fig.3Results of samples determination

从上图3中可以看出，经实验结果表明，金花葵干花的含量为228.0 mg/g，果实的含量为101.73 mg/g，叶的含量为90.93 mg/g，油的含量为70.77 mg/g，茎的含量为63.82 mg/g，酒的含量为62.26 mg/g。依数据可见，金花葵中黄酮含量极高。所测定的金花葵各部分中总黄酮的含量在62.0 mg/g～228.0 mg/g之间。而黄酮含量最高的是金花葵干花，可达228.19 mg/g。由此可见，金花葵全身是宝，黄酮含量较高，其中干花含量最高。

3　结论

本试验是测定金花葵干花、果、叶、茎、酒、油里面的总黄酮含量，采取的测定方法是硼氢化钠/氯醌（SBC）比色法、紫外分光光度计法。所测定的金花葵各部分中总黄酮的含量在62.0 mg/g～228.0 mg/g之间。黄酮含量最高的是金花葵干花，可达228.19 mg/g。

SBC法是一种新的测定包括黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类、黄烷醇（儿茶素）和花色苷等总黄酮的方法，本方法还具有很高的准确度和精密度，对黄酮含量的测定具有专一性，可广泛用于水果、蔬菜、谷类、保健营养品中总黄酮含量的测定。本文采用SBC法测定金花葵黄酮含量，以期为金花葵成分及产品的研发提供参考。

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Determination of Total Flavonoid Contents of Hibiscus manihot L.with SBC Method

CHEN Liang，XIN Xiu-lan*，LI Ye，WANG Xiao-jie，FENG Hui
（College of Bioengineering，Beijing Polytechnic，Beijing 100176，China）

The total flavonoid contents of the dried flowers，fruits，leaves，stems，wine and oil of Hibiscus manihot L.were studied in this paper.Rutin was used as standard，and the new method-sodium borohydride/chloranilbased（SBC）colorimetric method was employed to determine the contents of total flavonoid in samples of Hibiscus manihot L..The results showed that total flavonoid contents of each plant part and product of Hibiscus manihot L.were among 62.0 mg/g-229.0 mg/g，and the content of total flavonoid of Hibiscus manihot L.flower was highest，up to 228.19 mg/g，which provided reference for Hibiscus manihot L.products development.

Hibiscus manihot L.；total flavonoid contents；sodium borohydride/chloranil-based colorimetry（SBC）

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.025

2016-04-13

北京电子科技职业学院科技类博士资助课题（YZKB2014005）；北京市教委科技计划面上项目（KM201510858001）；北京电子科技职业学院科研团队项目（TD201602）；公益性行业（农业）科研专项（201103037）

陈亮（1986—），男（汉），讲师，博士，研究方向：天然产物的研究与开发。

辛秀兰（1968—），女（汉），教授，博士，研究方向：小浆果资源的研究与推广。