龙眼核多酚提取物对酪氨酸酶抑制作用的研究

关天旺，杨航，刘嘉煜，唐福才，王漫妮，李迅，林锦裕，秦玲玲，吴文浩

（1.广州医科大学第二临床学院，广东广州510000；2.广州医科大学第一临床学院，广东广州510000；3.广州医科大学金域检验学院，广东广州510000；4.广州医科大学第三临床学院，广东广州510000；5.广州医科大学护理学院，广东广州510000；6.广州医科大学药学院，广东广州510000）

龙眼核多酚提取物对酪氨酸酶抑制作用的研究

关天旺1，杨航1，刘嘉煜1，唐福才2，王漫妮3，李迅4，林锦裕4，秦玲玲5，吴文浩6，*

（1.广州医科大学第二临床学院，广东广州510000；2.广州医科大学第一临床学院，广东广州510000；3.广州医科大学金域检验学院，广东广州510000；4.广州医科大学第三临床学院，广东广州510000；5.广州医科大学护理学院，广东广州510000；6.广州医科大学药学院，广东广州510000）

研究龙眼核多酚提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用。用龙眼核多酚提取物，分别以L-酪氨酸、L-多巴为底物，在475 nm处测定溶液吸光度和吸光度的变化，观察龙眼核多酚对单酚酶、双酚酶活性的影响。结果表明龙眼核多酚对酪氨酸单酚酶、二酚酶均有抑制作用，半抑制浓度IC50分别为12.68、11.81 mg/mL。龙眼核多酚为酪氨酸酶可逆竞争性抑制剂，抑制常数（KI）为0.538mg/mL。

酪氨酸酶；龙眼核；多酚；抑制作用；酶动力学

酪氨酸酶是一种广泛存在于生物体内、催化黑色素合成的关键限速酶，同时具有单酚酶和二酚酶活性［1-2］。它与生物体的重要生理过程密切关系，其过量表达，既可导致人体色素沉着性疾病如雀斑、黄褐斑、黑色素瘤的形成［3-4］，也可加速果蔬的褐变［5］，此外，还参与昆虫蜕皮过程的鞣化作用［6］。酪氨酸酶抑制剂可被广泛用于医药［7］、食品保鲜剂［8］、杀虫剂等领域。然而，传统酪氨酸抑制剂多为化学合成，存在一定的毒副作用，如曲酸长期接触可导致皮肤癌、皮炎、细胞毒性［9］等和对苯二酚可导致永久脱色［10］。因此，研发和寻找高效无毒、特异性强的酪氨酸酶抑制剂已成为医药、农学、食品等领域的研究热点。

多酚即多羟基苯，广泛存在于植物及微生物中，对人体有益［11-12］，具有清除自由基、抗氧化、与金属离子的络合等特性［13］。其可通过清除自由基和络合酪氨酸酶活性中心的铜离子，抑制酪氨酸酶活性。国内外研究表明苹果多酚［14］、柿子叶多酚［15］等多酚对酪氨酸酶具有抑制能力。多酚具有成为酪氨酸酶抑制剂之一的巨大研发潜力。

研究表明，龙眼核中具有丰富的多酚类物质，抗氧化活性仅次于芒果核多酚［16-17］。本课题组前期试验表明，从龙眼核中提取的多酚类物质具有良好体外抗氧化活性，对羟自由基、DPPH自由基均具有良好清除作用［18］。但目前关于龙眼核多酚作为酪氨酸酶抑制剂研究的报道鲜有见到。

本文以“石硖”龙眼核为原料，通过超声波辅助提取法得到龙眼核多酚提取物，探究其对酪氨酸酶活性的抑制作用和抑制机理，为龙眼核多酚作为酪氨酸酶抑制剂的开发研究，提供前期试验基础和依据，为龙眼核的开发提供新思路。

1　材料和方法

1.1材料与仪器

“石硖”龙眼核：产地广州番禺；酚试剂、乙酸乙酯、无水乙醇、二甲基亚矾（DMSO）、没食子酸（均为分析纯）：购买于百灵威科技有限公司；磷酸盐缓冲溶液（0.05 mmol/L，pH=6.8）L-酪氨酸、左旋多巴、蘑菇酪氨酸酶（活力比≥500 U/mg）：均购于阿拉丁试剂有限公司；RE-52C旋转蒸发仪：巩仪市予华仪器有限责任公司；SHZD（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市英予华仪器厂；KQ-500VDE型三频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；BS-124S电子天平：SartoriusAG Sar torius；DFT-250手提式中药粉碎机：贵州三阳包装设备有限公司；MK3全自动酶标分析仪：芬兰Thermo公司。

1.2方法

1.2.1超声波辅助法提取龙眼核多酚［18］

将龙眼核洗净，置于恒温干燥箱中，40℃干燥至恒重，将其粉碎并过60目筛。称取50 g的龙眼核粗粉，以1∶20（g/mL）的料液比，加入75%的乙醇溶液，在温度60℃条件下，超声波（功率100%）辅助提取50 min，减压抽滤得到多酚提取液，等同条件重复提取滤渣3次，合并滤液，50℃下旋干浓缩至一定体积，再用饱和食盐水萃取并洗涤3次，加入足量Na2SO4干燥过夜。次日，减压抽滤取上清液，在50℃下旋干得到多酚浸膏，称量。

1.2.2多酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteus法［18］测定多酚含量。以没食子酸为标准品，称取没食子酸50 mg，加入蒸馏水定容至500 mL，得到0.1 mg/mL的没食子酸标准液。常温下，取8支10 mL试管分别加入没食子酸标准液0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mL，用蒸馏水补足至2 mL，加入福林酚试剂1.0 mL摇匀，静置4 min，再加入10%碳酸钠溶液1.0 mL，摇匀后于25℃条件下静置2 h，在750 nm波长下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，没食子酸含量（μg）为横坐标，制作标准曲线。

用DMSO将龙眼核多酚浸膏配制成1mg/mL的样品液，在750 nm处测其吸光度，重复3次。以标准曲线算出样品浓度，并按公式（1）计算提取率。

式中：c为样品的质量浓度，mg/mL；v为样品稀释后的体积，mL；m为龙眼核粉质量，mg。

1.2.3多酚提取物抑制酪氨酸酶活性的测定

1.2.3.1单酚酶抑制活性测定

以1mmol/L的L-酪氨酸为底物，先配制50 mg/mL的多酚提取物母液，再用DMSO分别稀释成为5、10、20、40 mg/mL的样品溶液。在96孔板中加入总体积为160 μL的反应体系，依次加入100 μL的PBS溶液、10 μL的4 mg/L酪氨酸酶、10 μL样品溶液后25℃孵育10 min，之后迅速加入40 μL的L-酪氨酸，混匀。5 min后，在475 nm吸光度处，用酶标仪每隔1 min进行吸光度测定，试验重复3次。每1 min吸光度的变化值记为ODA1。将10 μL样品替换成10 μL DMSO，测定值记为ODB1。样品对酪氨酸酶的抑制率的计算公式为

1.2.3.2二酚酶抑制活性测定

以7.6 mmol/L的左旋多巴（L-DOPA）为底物，将50 mg/mL多酚提取物母液用DMSO分别稀释成5、10、20、40 mg/mL的样品溶液，在96孔板中加入总体积为190 μL的反应体系，依次加入150 μL的PBS溶液、5 μL的2 mg/mL酪氨酸酶、5 μL样品溶液后25℃孵育10min，之后迅速加入30 μL的L-DOPA，混匀。在475 nm吸光度处，立即用酶标仪每隔30 s进行吸光度测定，试验重复3次。每30s吸光度的变化值记为ODA2。将5 μL样品替换成5 μL DMSO，测定值记为ODB2。样品对酪氨酸酶的抑制率的计算公式为

1.2.3.3二酚酶抑制活性的动力学分析

按照1.2.3.2的反应体系和试验方法，选取多酚提取物浓度为10、20 mg/mL以及空白组3个系列，改变酪氨酸酶浓度（2、4、5、6 mg/mL）。每隔30 s于475 nm下测定吸光度，重复3次试验。用酪氨酸酶浓度对酶催化活性作图。

按照1.2.3.2的反应体系和试验方法，保持酶质量浓度（2 mg/mL）不变，改变底物多巴的含量（最终为0.6 mmol/L～2.4 mmol/L），于475 nm处测定吸光度的变化值，采用Lineweaver-Burk双倒数法作图，通过米氏常数Km和酶促反应最大速率vm的变化来判断抑制类型。

1.3数据处理

采用SPSS13.0软件进行统计学分析。试验数据采用方差分析（ANOVA）和t检验，显著性水平为P＜0.05，极显著性水平为P＜0.01。

2　结果与分析

2.1龙眼核多酚提取物的得率与多酚含量

按1.2.2的方法制作没食子酸标准曲线，标准曲线的回归方程为y=10.024x-0.662 7，R2=0.999 2，在试验浓度范围内具有良好的线性关系。提取得率为1.435%，1 g龙眼核粉提取的多酚质量为14.35 mg。

2.2龙眼核多酚提取物对酪氨酸酶抑制活性的影响

2.2.1多酚提取物对酪氨酸酶单酚酶抑制活性的影响

龙眼核多酚提取物对酪氨酸酶活性抑制率的量效关系见图1。

图1　对单酚酶抑制曲线Fig.1Inhibitory effect on monophenolase activity of rosinase

在一定浓度范围（5 mg/mL～20 mg/mL）内多酚提取物对酪氨酸酶活性的抑制率呈剂量依赖效应关系（y= 2.357 7x+20.1，R2=0.999 4），即抑制率随着样品浓度的增大而增大。根据线性回归方程获得多酚提取物对酪氨酸酶活性的半抑制浓度IC50为12.68 mg/mL。

2.2.2多酚提取物对酪氨酸酶二酚酶抑制活性的影响

龙眼核多酚提取物对酪氨酸酶活性抑制率的量效关系见图2。

图2　对二酚酶抑制曲线Fig.2Inhibitory effect on diphenolase activity of ty tyrosinase

在一定浓度范围内（5 mg/mL～20 mg/mL）多酚提取物对酪氨酸酶活性的抑制率呈剂量依赖效应关系（y= 3.400 1x+9.855，R2=0.999 8），即抑制率随着样品浓度的增大而增大。根据线性回归方程获得多酚提取物对酪氨酸酶活性的半抑制浓度IC50为11.81 mg/mL。

2.3多酚提取物对酪氨酸酶二酚酶活性抑制的动力学分析

2.3.1多酚提取物对不同浓度酪氨酸酶二酚的抑制作用

多酚提取物对不同浓度酪氨酸酶二酚的抑制作用结果如图3所示。

图3　多酚提取物对不同浓度酪氨酸酶二酚酶活性抑制作用Fig.3Inhibitory effect of polyphenol extracts on different concentrations of diphenolase of tyrosinase

在底物浓度和龙眼核多酚提取物质量浓度不变的条件下，随着酪氨酸酶浓度的提高，反应体系的吸光度值OD475呈线性增加；而在底物浓度和酪氨酸酶浓度不变的情况下，OD475随多酚提取物质量浓度的提高而下降。以OD475对酪氨酸酶浓度［En］作图，直线斜率随提取物质量浓度增加而下降，说明龙眼核多酚提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用不是通过降低有效酶量，而是通过降低酶活性实现的，表现为可逆性抑制作用。

2.3.2多酚提取物对酪氨酸酶二酚酶的抑制动力学

研究龙眼核多酚对酪氨酸酶二酚酶抑制作用类型，在酶活测定体系中，固定酶的浓度，改变L-DOPA浓度，测定不同浓度抑制剂对酶活力的影响，作Lineweaver-Burk双倒数图，判断抑制剂的抑制类型。对二酚酶的Lineweaver-Burk图如图4所示，抑制剂与酶结合时的平衡常数如图5所示。

图4　对二酚酶的Lineweaver-Burk图Fig.4Lineweaver-Burk plots for inhibition of poyphenol extract on diphenolase of tyrosinase

图5　抑制剂与酶结合时的平衡常数Fig.5The inhibition constant（KI）

由Lineweaver-Burk双倒数作图（图4）得到1组纵轴截距不变的直线，说明龙眼核多酚作为酪氨酸酶抑制剂，不改变酶促反应的最大反应速度（Vmax），只影响米氏常数（Km），其抑制类型为竞争性类型，表现为酶对底物的亲和力下降，抑制剂的存在阻碍了底物和酶的结合。相反，底物和酶的结合也阻止抑制剂与酶分子的结合，底物与抑制剂同酶分子的结合是互相竞争的，增加底物浓度可以排除抑制剂对酶的效应，表现出酶反应的Vmax不随着抑制剂浓度增大而变化。由此说明龙眼核多酚只能与游离酶（E）结合，而不能与酶-底物络合物（ES）结合。

以图5中各浓度抑制剂对应的直线结合米氏方程计算出米氏常数（Km），以Km对抑制剂浓度作图（图5），获得一条斜率为0.538的直线，进而可知该抑制剂与酶结合时的平衡常数，即抑制常数（KI）为0.538 mg/mL。

3　讨论

酪氨酸酶由两个含铜离子位点构成其活性中心［1］，同时具有单酚酶和二酚酶活性［2］。酪氨酸酶首先将L-酪氨酸羟基化生成L-多巴，然后将L-多巴氧化成多巴醌，最后多巴醌在酶促和非酶促反应下生成色素物［19］。通过对该关键酶的调控，抑制其活性，可以减少黑色素的形成。

本文选用采用超声提取龙眼核多酚，并测定其对酪氨酸酶活性的影响。试验结果表明：在一定浓度范围内（5 mg/mL～20 mg/mL），龙眼核多酚提取物对酪氨酸酶活性的抑制率呈剂量依赖效应关系，即抑制率随着样品浓度的增大而增大，对酪氨酸的单酚酶、二酚酶活力均有抑制作用，这与市面常用酪氨酸抑制剂曲酸［20］、熊果甙［21］的研究吻合，这可能是由于龙眼核多酚提取物中含有鞣花酸、没食子酸、柯里拉京、没食子酸乙酯等［22-23］，有大量酚羟基存在，其与底物结构相似可以结合酪氨酸酶的铜离子活性中心，并可清除活性氧而拮抗酪氨酸酶的激活。龙眼核多酚提取物对酪氨酸的单酚酶、二酚酶活力半抑制浓度IC50分别为12.68、11.81 mg/mL，这低于文献报道的一些植物多酚提取物的IC50，如白芨水提取物［24］（二酚酶IC5028 mg/mL）、低榆多酚70%丙酮提取物［25］（二酚酶IC5014.5 mg/mL），提示了龙眼核多酚提取物具有良好的酪氨酸酶抑制作用，且效果优于部分植物多酚提取物。

根据抑制剂与酶作用的特点，酶抑制类型可分为可逆抑制和不可逆抑制，前者又分为竞争性抑制、非竞争性抑制、混合型抑制及缓慢结合型抑制。其中，竞争性抑制的主要机理为底物类似物结合酶的铜离子活性中心抑制酶活性；混合型的主要机理为抑制剂对酶活性中心的内源桥基的影响；非竞争性的主要机理为抑制剂对氧自由基的清除作用以及抑制剂与酶活性中心以外的氨基酸残基结合。

经抑制动力学研究，证实龙眼核多酚对酪氨酸二酚酶为可逆竞争性抑制。即龙眼核多酚与底物同酶的结合是相互竞争的，酶分子的空间结构并没有发生不可逆性的变化。这与大多数酪氨酸酶抑制剂的抑制类型吻合［26］，如槐花提取物［27］、川穹提取物［28］、熊果甙［21］等对酪氨酸二酚酶均为竞争性抑制。这提示龙眼核多酚虽然具有良好体外清除自由基的活性，但发挥对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用时，主要依赖提取物中的多酚与底物左旋多巴有相似的结构。龙眼核多酚竞争性与酪氨酸酶铜离子活性中心结合，将黑色素合成的反应链中部分酪氨酸酶带走，降低酪氨酸酶在该反应体系的浓度，从而抑制色素物质的合成。这与国外部分文献报道一致，Kubo［29］等对旋复花异囊菊黄酮醇提取物的研究表明，其中一种黄酮醇物质——槲皮素通过与酪氨酸酶活性中心结合而降低酪氨酸酶活性，No J K［30］等也发现绿茶提取物竞争性抑制酪氨酸酶。

结合本课题组前期试验，龙眼核多酚不仅可作为抗氧化物质潜在资源，也是天然的酪氨酸酶可逆竞争性抑制剂，具有较高的应用价值和经济效益。然而龙眼核多酚提取物为混合物，其成分较复杂，本研究结果为多种物质对酪氨酸酶的综合抑制作用。下一步可分离龙眼核多酚提取物活性单体化合物并研究其对酪氨酸酶的抑制功效，从中寻找到高活性的天然酪氨酸酶抑制剂。

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Inhibitory Effect of Polyphenol Extracted from Longan Seed on Tyrosinase

GUAN Tian-wang1，YANG Hang1，LIU Jia-yu1，TANG Fu-cai2，WANG Man-ni3，LI Xun4，LIN Jin-yu4，QIN Ling-ling5，WU Wen-hao6，*
（1.The Second Clinical College，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510000，Guangdong，China；2.The First Clinical College，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510000，Guangdong，China；3.KingMed School of Laboratory Medicine，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510000，Guangdong，China；4.The Third Clinical College，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510000，Guangdong，China；5.Nursing College，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510000，Guangdong，China 6.The Medicine College，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510000，Guangdong，China）

This study evaluated the tyrosinase inhibitory activity of polyphenol extracted from longan seed.The inhibitory kinetics of tyrosinase including monophenolase and diphenolase were studied via enzymological kinetic method using L-Tyrosine and L-Dopa as substrates.It was found that polyphenol extracted from longan seed showed significant inhibitory activities against monophenolase and diphenolase in tyrosinase，and the IC50values were 12.68mg/mL and 11.81mg/mL，respectively.Utilizing kinetic analysis，the inhibition effect was conformed to be a reversible competitive inhibition，and the inhibition constant（KI）was determined to be 0.538mg/mL.

tyrosinase；longanseed；polyphenol；inhibitoryeffect；enzymekinetics

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.004

2016-05-31

2015年广东省大学生科技创新培育专项资金项目（pdjh20150439）；2015-2016年度广州医科大学大学生科技创新项目（2015B002）；2016年广东省大学生科技创新培育专项资金资助项目（pdjh2016a0406）；广州医科大学博士科研启动项目（20121C23）；广东省中医药局建设中医药强省科研项目（20132208）；广东高校优秀青年创新人才培养计划项目（2013LYM_007）

关天旺（1992—），男（汉），本科在读，主要从事天然药物研究。

吴文浩（1983—），男，讲师，博士，主要从事药物化学研究。