康莱特对晚期乳腺癌患者外周血CD4及PD-1阳性T细胞的影响△

谢有科　黄丁平

广西中医药大学附属瑞康医院肿瘤科，南宁530011

康莱特对晚期乳腺癌患者外周血CD4及PD-1阳性T细胞的影响△

谢有科#黄丁平

广西中医药大学附属瑞康医院肿瘤科，南宁530011

目的检测康莱特（KLT）对晚期乳腺癌患者外周血CD4+及程序性死亡分子1（PD-1）阳性T细胞比例的影响，探讨KLT在乳腺癌患者中诱导抗肿瘤免疫的作用。方法选取接受过化疗或内分泌治疗后肿瘤进展的晚期乳腺癌患者30例，以KLT注射液处理；处理前后取外周血经流式细胞术检测治疗前后外周血中CD4+和CD4+PD-1+T淋巴细胞数量变化。并选取同期健康体检者20名为对照组，常规抽血检测。结果晚期乳腺癌患者治疗前外周血CD4+T细胞较健康人群低，而CD4+PD-1+T细胞的比例较健康人群高；经KLT治疗后的晚期乳腺癌患者外周血CD4+T细胞较治疗前显著增高，而CD4+PD-1+T细胞的比例较治疗前显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论KLT有效降低晚期乳腺癌患者外周血CD4+PD-1+T淋巴细胞比例，减弱机体肿瘤免疫抑制状态。

乳腺癌；康莱特；CD4；PD-1；免疫

Oncol Prog，2016，14（6）

乳腺癌的发生、发展、复发和转移是多因素共同参与的复杂过程，与机体免疫功能密切相关。免疫监视的失能，T细胞功能缺失及免疫抑制因子的产生是肿瘤免疫耐受的重要原因。程序性死亡分子1（programmed death-1，PD-1）是细胞免疫调控中的负性调控分子，主要表达于淋巴细胞表面。研究证明，PD-1及其配体PD-L1通路在肿瘤细胞和其浸润的淋巴细胞中的表达与部分恶性肿瘤患者预后密切相关［1-2］。PD-1/PD-L1阻断剂（如KEYTRUDA、Opdivo）在非小细胞肺癌和黑色素瘤等临床试验中显示出了巨大的临床潜力，以PD-1/PDL1为代表的免疫治疗成为继手术治疗、化疗、放疗、分子靶向治疗之后的新方法［3-4］。但这些PD-1单抗药物价格昂贵，存在不同程度不良反应，在临床上受到一定的限制。传统中医中药在调节身体亚健康状态和免疫平衡等方面具有明显的优势。以薏苡仁为原料制备而成的多功能药物康莱特（KLT）具有直接抗肿瘤作用和多种免疫调节作用，在临床上广泛应用于免疫调节和辅助化疗，并取得较好的疗效［5-7］。本研究探讨CD4+T淋巴细胞作为机体细胞免疫功能的重要组成部分，KLT对晚期乳腺癌患者外周血中CD4+和（或）PD-1+T细胞的影响，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2014年12月至2015年8月收治的晚期乳腺癌患者30例，年龄38～85岁，中位年龄57岁。其中Ⅲb期11例，Ⅳ期19例；病理类型：浸润性导管癌24例，浸润性小叶癌6例。入组标准：经病理、影像等检查，确诊为浸润性导管癌或浸润性小叶癌，至少接受过内分泌治疗和（或）解救化疗，出现内分泌治疗耐药或不耐受化疗合并肿瘤进展。排除标准：有心脑肾等重要器官功能异常；预期存活时间＜3个月。另取20名同期体检健康者作为对照组，中位年龄52岁。

1.2治疗方法

乳腺癌患者按产品说明书予静脉滴注康莱特注射液200 ml，每日1次，3周为一个疗程，治疗期间予支持治疗，不行化疗或靶向治疗等抗肿瘤治疗，休息2～7 d后进行第2个疗程，共行两个疗程。

1.3检测指标

乳腺癌患者在治疗前和治疗后1周分别抽静脉血5 ml进行检测。健康体检者即时抽取静脉血。采用流式细胞术检测乳腺癌患者治疗前后和健康体检组外周血中CD4及PD-1双阳性T淋巴细胞比例，并进行分析。流式细胞术检测流程如下：取混匀后的外周血每管100 μl，加入10 μl Fc受体封闭液（美国BD公司），混匀，置于室温10 min；再加入5 μl荧光抗体：PE-anti-hCD4抗体（sc-1176PE，购于Santa Cruz公司），FITC-anti-hPD-1抗体（ab95791，购自abcam公司），混匀，置于室温，避光孵育30 min，加入磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），2000 r/min，5 min离心以除去非特异性结合抗体；加入1 ml红细胞裂解工作液（购自美国BD公司）置于室温10 min，离心后弃上清，再以PBS洗涤1次；然后用少量PBS重悬细胞，上机分析。采用流式细胞仪（BD FACS ARIA）进行检测。

1.4统计学方法

采用SPSS13.0统计-软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较进行独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组外周血中CD4+、PD-1+T细胞比例比较

晚期乳腺癌患者外周血中CD4+细胞低于对照组，而CD4与PD-1双阳性T细胞比例高于对照组，两组比较差异具有统计学意义（P=0.001、0.003）。（表1、图1）+T细胞比例比较

表1　晚期乳腺癌患者与健康人群组外周血T细胞亚群比较（%±s）

表1　晚期乳腺癌患者与健康人群组外周血T细胞亚群比较（%±s）

2.2治疗前后患者外周血CD4+PD-1+T细胞比例比较

KLT治疗后晚期乳腺癌患者外周血CD4+PD-1+T细胞的比例较治疗前显著降低，CD4+T细胞较治疗前显著增高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表2、图1）

图1　晚期乳腺癌患者及对照组患者外周血中CD4+及PD-1+T细胞比例

表2　晚期乳腺癌患者治疗前后外周血T淋巴细胞亚群比例比较（%±s）

表2　晚期乳腺癌患者治疗前后外周血T淋巴细胞亚群比例比较（%±s）

3　讨论

乳腺癌患者经过内分泌治疗如他莫昔芬、芳香化酶抑制剂和（或）卵巢功能抑制后出现全身多发转移，进入肿瘤晚期。对于晚期乳腺癌患者，目前临床治疗方法包括化疗，曲妥珠单抗靶向治疗，新型内分泌药物（如氟维司群）和新型药物（palbociclib、依维莫司等）治疗［8］。从国内临床实践来看，化疗并不能阻止肿瘤的进展，而一些新的治疗方法，如靶向药物、新型药物等都因价格昂贵而阻碍其在临床上的应用。PD-1/PD-L1阻断剂作用机制研究表明，当CD4+T细胞存在的情况下，PD-L1阻断剂首先阻断CD4+T细胞表面的PD-L1，继而活化CD4+T细胞；当CD4+T细胞活化后才开始阻断CD8+T细胞表面PD-L1进而活化CD8+T细胞。因为肿瘤诱导CD4+CD25+调节性T细胞可抑制免疫应答［9］，削弱CD8+T细胞在抗肿瘤中的作用，所以PD-1/PD-L1阻断剂的肿瘤杀伤效应在无CD4+T细胞介导时效率更高［10］。PD-1/PD-L1阻断剂给人们带来全新的启示：通过抑制肿瘤组织内浸润的淋巴细胞可以激活机体肿瘤免疫，从而得到持久的抗肿瘤免疫效果。

PD-1是表达于多种肿瘤表面的共抑制分子，它在介导乳腺肿瘤细胞免疫逃逸中起着重要作用。PD-1的主要配体PD-L1（B7-H1）选择性地表达在许多肿瘤上和肿瘤微环境内的抗原提呈细胞、活化T细胞、活化B细胞、巨噬细胞上。而CD4+T淋巴细胞分为多个功能亚群，在抗肿瘤免疫中起关键作用，在癌症患者中表达水平普遍降低。研究表明，CD4+T淋巴细胞表达抑制性分子PD-1在不同健康状态下呈现不同的改变，如胃腺癌患者外周血中CD4+T细胞表面PD-1表达较健康人群明显上调，而且晚期患者外周血CD4+PD-1+T细胞的比例明显高于早期患者［1］。而肿瘤内浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）因肿瘤细胞原因而处于功能受损或缺失状态，特别是乳腺癌组织中PD-1+、TIL和FOXP3+（forkhead box P3+），TIL往往提示预后不佳［11］。本研究结果显示，晚期乳腺癌患者CD4+T淋巴细胞低于健康人群，而CD4+PD-1+T淋巴细胞高于健康人群，这说明晚期乳腺癌患者机体免疫功能处于免疫低下状态，而且CD4+PD-1+T淋巴细胞代表的肿瘤免疫逃逸处于高峰状态。尽管未见乳腺癌外周血及TIL中的CD4+PD-1+T淋巴细胞之间相关性的报导，本课题组推测两者之间可能表现为正相关关系，即外周血CD4+PD-1+T淋巴细胞可代表同种表型的TIL，提示乳腺癌病灶局部微环境中的抗肿瘤免疫状态高于健康人群。

康莱特对多种肿瘤细胞具有显著的抑制和杀伤作用，临床主要用于提高化疗敏感性，诱导细胞凋亡，减轻化疗不良反应及免疫调节作用。研究表明，康莱特可显著提高化疗患者CD3+、CD4+、CD4/CD8值，保护化疗过程中机体的免疫功能，增强化疗耐受性［6］。本研究也提示康莱特能明显提高晚期乳腺癌患者外周血CD4+T淋巴细胞比例，结果与既往文献报道相符［6］。更重要的是，康莱特治疗后晚期乳腺癌患者外周血CD4+PD-1+T淋巴细胞较治疗前明显下降，说明康莱特在上调机体免疫力的同时，减弱肿瘤免疫耐受，有助于诱导特异性肿瘤免疫，提高机体抗肿瘤免疫水平。但康莱特治疗后外周血CD4+PD-1+T淋巴细胞水平下降仍高于健康人群的数值，提示康莱特阻断PD-1/ PD-L1通路的能力相对较弱，可能需要结合其他治疗手段，特别是靶向PD-1/PD-L1通路的药物，以达到有效控制肿瘤的目的。同时本结果不排除因晚期乳腺癌患者肿瘤负荷过大所致的康莱特疗效减弱。

本研究发现，康莱特治疗晚期乳腺癌，可以提高患者的外周血CD4+T细胞比例，降低CD4+PD-1+T淋巴细胞比例，从而提高患者机体免疫功能，减弱局部肿瘤免疫抑制状态。

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The effect of Kanglaite on the PD-1+and CD4+T lymphocytes in the peripheral blood of patients with advanced breast cancer△

XIE You-ke#HUANG Ding-ping
Department of Oncology，Ruikang Hospital，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530011，Guangxi China

ObjectiveTo investigate the effect of Kanglaite（KLT）on the PD-1+and CD4+T lymphocytes in peripheral blood of patients with advanced breast cancer（ABC），and discuss the role of KLT in inducing anti-cancer immune response in these patients.Method30 patients with ABC who had prior chemotherapy or endocrine therapy were included in this study as study group，given KLT injection，and the peripheral blood of these patients were sampled before and after treatment of KLT to determine the level of T lymphocytes of CD4+and CD4+/PD-1+using flow cytometry.Another 20 case of healthy adults were enrolled as control，whose peripheral blood was sampled and tested with the same procedure as in study group.ResultThe level of CD4+T lymphocytes in the peripheral blood of ABC patients before treatment was lower than that in control group，but the level of CD4+/PD-1+in these patients was notably higher.After treatment of KLT，the level of CD4+was increased in study group after treatment，and the level of CD4+/PD-1+was lower than that before treatment，with statistically significant difference observed（P＜0.05）.ConclusionKLT is effective in decreasing the level of CD4+PD-1+T lymphocytes in peripheral blood of advanced breast cancer patients，and thus attenuates tumor immunosuppression status in those patients.

breast cancer；Kanglaite；CD4；PD-1；immune

R737.9

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.06.07

2016-01-14）

国家自然科学基金（81560476）；八桂学者建设工程专项经费资助

（corresponding author），邮箱：xieyouke1215@sina.com.